浓香型高温酒曲中蛋白酶产生菌的筛选与鉴定

黄家驷+刘盾+陈玄阳+王珊珊+陈燕+程爽

摘 要：该研究利用酪蛋白选择性培养基从浓香型高温酒曲中分离得到1株有明显水解圈的蛋白酶产生菌LS-1，经16SrDNA鉴定其为地衣芽孢杆菌；LS-1通过发酵培养提取出粗酶液，其酶活为180U/mL。

关键词：酒曲；蛋白酶；筛选；鉴定

中图分类号 Q93-31 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）21-0029-03

Isolation and Identification of Protease-producing Srains from Luzhou-flavor Liquor Starter

Huang Jiasi1 et al.

（1School of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Abstract：A protease-producing strain was isolated from Luzhou-flavor Liquor Starter with casein-selective medium，named LS-1. The 16SrDNA was amplified by PCR and the amplification products was subjected to sequencing and homology analysis. As a result，strain LS-1 was identified as Bacillus licheniformis. The protease activity in fermentation broth was 180U/mL.

Key words：Liquor Starter；Protease；Isolation；Identification

白酒是我国传统的发酵食品，有着悠久的历史，从古至今一直受到人们的喜欢。中国传统白酒是以富含淀粉质的粮谷类为原料，以中国酒曲为糖化发酵剂，采用固态、半固态或液态发酵，经蒸馏、贮存和勾调而成的含酒精的饮料[1]，被列为世界著名六大蒸馏酒之一。因酿造原料、酒曲种类和生产工艺以及自然环境等因素的不同，形成了特色、风格不同的各种香型的白酒。酿造原料、酒曲种类和生产工艺以及自然环境等影响着白酒香型的形成。根据我国白酒的生产工艺可以看出，白酒酿造过程实质上是相关微生物的代谢过程，其微生物主要来源于酒曲、窖泥和酒醅，参与酒精及香味物质的形成，是影响典型香型形成的重要因素，酿酒微生物的种类、数量、分布及其消长变化等对白酒发酵途径及最终产物的生成均有着重大的影响[2]。白酒生产中酿酒微生物的研究水平直接影响白酒生产技术水平，进而影响白酒的质量、微生物群落结构，尤其是风味微生物菌群结构，对于白酒的产量与质量起着决定性的作用[3-4]。

酒曲是微生物的培养物，是白酒生产中的糖化剂、发酵剂、产香剂，有“酒之骨”之称。酿酒的糖化过程，是酒曲中蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和果胶酶的协同作用的结果[5]。其中酒曲中的蛋白酶在酿酒过程中更是起到至关重要的作用。蛋白酶是分解蛋白质肽键一类水解酶的总称。它能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒间质细胞壁的结构，使原料中可利用的碳源增加；同时由于蛋白质的水解作用，提高了发酵料中氨基态氮的含量，促进酵母生长繁殖，加快发酵速率[6]。在白酒生产过程中不能忽视蛋白酶，从酒曲中选育出高产蛋白酶应用于酿酒工业，将极大改善酒曲性能，提高酒的质量和产率，缩短生产周期，降低生产成本。目前对于浓香型白酒酿酒微生物研究较多，主要集中在酒曲微生物产淀粉酶的菌株的研究，而对产蛋白酶菌株研究相对较少。为此，本文拟以河南本地浓香型白酒高温酒曲为研究对象，对其中的可培养产蛋白酶微生物进行分离鉴定和产酶特性研究，从微生物的角度进一步理解白酒的发酵本质，以期从中获得具有一定工业应用潜力的产酶菌株，为白酒生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酒曲 取自河南新境界酒业有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器 （1）试剂：酪蛋白、牛肉膏、琼脂粉等均为生物纯，北京奥博星；葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、 KH2PO4等均为分析纯，天津科密欧；L-酪氨酸，分析纯，sigma进口分装；Folin-酚试剂：北京索莱宝；细菌DNA基因组提取试剂盒，北京天根；PCR及电泳所用试剂均购自Takara。（2）仪器：上海精宏DNP-9052电热恒温培养箱；国华SHA-C水浴振荡器；上海安亭飞鸽TGL-16G高速台式离心机；上海申安LDZX-50KBS高壓灭菌锅；奥林巴斯CX23双目光学显微镜；BioDrop超微量紫外可见分光光度计；Biometra T-Profssional Standard PCR仪；北京六一DYY-7C电泳仪；北京六一DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽；北京君意东方JY04S-3E凝胶成像分析仪；上海精科752N分光光度计。

1.1.3 培养基 （1）酪蛋白培养基[7]：Na2HPO4·7H2O 1.07g，KH2PO4 0.36g，酪蛋白4g，ZnCl2 0.014g，NaCl 1.2g，CaCl2 0.002g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.02g，琼脂20g，pH7.0，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。（2）种子培养基[8]：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，pH7.0，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。（3）发酵培养基[8]：葡萄糖40g，蛋白胨20g，Na2HPO4 1.4g，CaCl2 0.6g，MgSO4 0.4g，pH7.0，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。（4）营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，pH7.0，蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌。endprint

1.2 方法

1.2.1 样品处理 （1）样品稀释液的制备：准确称取酒曲5g，研磨成粉，放入100mL的无菌生理盐水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，震荡至酒曲分散均匀后，即成10-1稀释液，将其进行梯度稀释，得到10-1～10-4稀释度的稀释液。（2）涂布平板法接种：用移液器依次吸取10-1～10-4样品稀释液200μL菌液至酪蛋白平板上，用涂布器将菌液在平板上涂布均匀。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min后转入37℃恒温培养箱，倒置培养。

1.2.2 筛选及鉴定 37℃培养48h后，对各个稀释度涂布平板进行观察，选择有较大透明圈的菌落利用划线分离法进行二次纯化；二次纯化后挑取有透明圈的单菌落接种至营养琼脂斜面上保存；挑取单菌落进行显微镜观察，初步形态观察后提取其基因组DNA进行16SrDNA的扩增，引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。将PCR产物送北京三博远志生物技术有限公司进行测序，测序完成后将序列利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）Blast数据库中进行16SrDNA相似性比较分析。

1.2.3 酶活测定 （1）粗酶液液制备：挑取将保存至斜面上的纯培养物接种至发酵培养基，37℃摇床培养48h后离心取上清进行酶活测定。（2）酪氨酸标准曲线：L-酪氨酸标准液：按表1配制，L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。

分别取上述溶液各1mL，各加碳酸钠溶液5mL、Folin-酚试剂溶液1mL，振荡均匀，于40℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于680nm，10mm比色皿，不含酪氨酸的0管为空白，分别测其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，利用回归方程，计算当吸光度为1时的酪氨酸量（μg），即为吸光常数K值，K值应在95～100。

（3）酶活测定：采用Folin-酚法[9]对粗酶液进行酶活测定。酶活力单位定义：40℃下，每分钟水解酪蛋白底物产生1μg酪氨酸，定义为为一个蛋白酶活力单位。将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min；取1mL粗酶液加入2mL预热好的酪蛋白溶液中混匀后放入40℃水浴中保温10min后加入1mL10%三氯乙酸终止反应，取1mL上清液加入0.55mol/LNa2CO35mL，加入1mLFolin-酚试剂至40℃水浴显色20min后于680nm下测定吸光值，以加水的反应体系为空白。计算酶活：从标准去线上读出最终稀释液的酶活力，单位U/mL，原液的酶活力按照下式计算：蛋白酶的活力（U/mL）=A×K×4÷10×n。

式中：A：发酵原液的平行实验的OD值；K：吸光常数；n：蛋白酶的液的稀释倍数；4：反应试剂的总体积；10：反应时间10min；所得结果表示至整数

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

2.1.1 菌落平板形态 在37℃培养48h后，在分离培养基上可以观察到有部分菌株周围产生肉眼可见水解圈，其中水解圈较大的菌落呈白色，扁平，干燥，周围呈雪花状，见图1。将该菌株命名为LS-1，对其进行革兰氏染色，镜检呈紫色，短杆状。

2.1.2 PCR产物扩增电泳分析 将菌株LS-1的16SrDNA产物进行琼脂糖凝胶分析，条带单一，约1.5kb（图2）。

（泳道1为Maker：DL2000；泳道2为样品）

2.1.3 16SrRNA序列分析及系统发育分析 LS-1 16SrRNA基因序列测序所获得序列长度为1438bp，将其与Genebank数据库中的序列进行同源性比对，发现LS-1与芽孢杆菌属的16SrRNA基因序列自然聚类，LS-1的16SrRNA基因序列与9条相似性较高的序列利用MEGA7.0构建系统发育树见图3，从图3中可看出，LS-1与Bacillus licheniformis strain AS-08E（GenBank：JN118574.1）聚为一群，相似性也最高，表明LS-1与Bacillus licheniformis strain AS-08E的亲缘关系最近。

2.2 LS-1酶活测定 根据图4可知，LS-1菌株粗酶液的酶活为180U/mL。与文献中其它酒曲源的蛋白酶产生菌相比，LS-1的蛋白酶活力一般，可能是未对其产酶条件进行进一步的优化研究。王丽等[10]从汾酒曲醅中筛选到一株高温蛋白酶芽孢杆菌W20，其在55℃时最高酶活为708.33U/mL。王俊英等[11]从宋河酒曲中分离到一株产蛋白酶芽孢杆菌M4，其最适酶活力温度为40℃，在此条件下酶活为366U/mL。

3 讨论

酒曲中微生物种类丰富，本文仅从样品中分离到一株产蛋白酶菌株LS-1，推测该菌株为酒曲中的优势菌，也可能是样品处理过程中未进行富集培养。目前已报道的高温产蛋白酶菌种来源多为枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌和脂肪芽孢杆菌，分离生境比较丰富，多为温泉、酒醅等环境。本文中筛选到的菌株LS-1为酒曲中筛选获得，在今后工作中将对其发酵条件和酶学性质进行深入研究，以期为该蛋白酶在食品、酿酒工业中的应用提供理论依据。

参考文獻

[1]余乾伟.传统白酒酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2010.

[2]傅金泉.中国酒曲技术的发展与展望[J].酿酒，2002，29（2）：7-9.

[3]徐颖宣，徐尔尼，冯乃宪，等.微生物混菌发酵应用研究进展[J].中国酿造，2008（9）：1-4.

[4]范光先，王和玉，崔同弼，等.茅台酒生产过程中的微生物研究进展[J].酿酒科技，2006（10）：75-77.

[5]乔宗伟，张文学，张丽莺，等.浓香型白酒发酵过程中酒醅的微生物区系分析[J].酿酒，2005，32（1）：18-22.

[6]王鹏昊，关统伟，邓奥宇，等.酒曲中高产蛋白酶和α-淀粉酶霉菌菌株的筛选与分子鉴定[J].酿酒科技，2016（6）：61-71.

[7]于华，黄丹，陈卓，等.酱香型大曲中产蛋白酶放线菌的分离及产酶条件研究[J].中国酿造，2017，36（2）：64-68.

[8]廉立慧，高丽君，王德才，等.高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析[J].生物技术通报，2011（3）：175-179.

[9]张彩莹，肖连冬.生物化学实验[M].北京：化学工业出版社，2009：10-67.

（责编：张宏民）endprint