高效液相色谱法测定食品中玉米赤霉烯酮的研究

董 梅，武琴园，薛海燕，杨 鸣，罗叶丽，李国薇，张 艳,*

1.渭南市检验检测研究院 (渭南 714000) 2.富平县检验检测中心 (渭南 711700)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)又称F-2毒素，是禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等真菌在玉米、小麦、谷物等生长过程中产生的一种次生代谢产物，具有非类固醇雌激素作用，可引起雌性畜禽的雌性激素综合征。玉米赤霉烯酮与肿瘤发生也有一定联系，被国际癌症研究中心归类为3类致癌物[1]。ZEA毒性强，污染范围广，去除困难，严重影响农作物产量，降低农产品品质，为此，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织已将解决ZEA问题做为当务之急，并且制定了食品中ZEN限量指标[2]。例如：澳大利亚规定谷物产品中的ZEN不能超过50 μg/kg，法国规定的植物油和谷类中ZEN不能超过200 μg/kg，我国规定谷物及其制品中不能超过60 μg/kg[3]。

GB 5009.209—2016[4]中规定了3种测定食品中玉米赤霉烯酮的方法，其中第一法为液相色谱法，适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋等食品中ZEA的测定；第二法为荧光光度法，仅用于油脂类的测定；第三法为液质法，适用于动物性食品的检测。因液相色谱-荧光检测方法稳定、可靠，对设备要求较低，广泛用于不同食品及饲料中ZEA的实验室检测和研究[5-9]。本文对标准规定的液相色谱法中不同食品基质的检测方法进行验证，建立实验室常规检测方法，满足日常监管需要。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

乙腈中玉米赤霉烯酮标准品，浓度50 μg/mL，批号90106FH，坛墨质检科技股份有限公司；小麦粉中玉米赤霉烯酮质控样品，产品编号MRM0014，批号C030951，北京美正检测技术有限公司；甲醇，色谱纯，德国默克公司；乙腈，色谱纯，德国默克公司；吐温-20；免疫亲和柱(BTR234Q)，北京博尔西科技有限公司；玻璃纤维滤纸。

1.2 主要仪器设备

Agilent1260型高效液相色谱仪，配荧光检测器；FJ200-S型高速均质器，杭州齐威仪器有限公司；MTN-5800A-24型氮吹仪，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；纯水机，德国赛多利斯集团；电子天平(0.001 g)，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1F-2储备液的制备

精确移取玉米赤霉烯酮标准品0.5 mL至25 mL容量瓶中，用乙腈溶解，配成1 μg/mL的标准储备液，-20 ℃避光保存。

1.3.2样品处理方法

依据GB 5009.209—2016[4]中规定的4种食品，按照提取和净化的过程分别处理。

1.3.3HPLC-FLD测定条件

色谱柱：Agilent C18柱，柱长150 mm,内径4.6 mm,粒度4 μm；流动相为乙腈-水-甲醇(46∶46∶8，v/v/v)；流速为1.0 mL/min；激发波长274 nm，发射波长440 nm；进样量为100 μL；柱温为室温(25 ℃)。

1.3.4系列标准溶液的配制

准确移取标准储备液50 μL、100 μL、300 μL、500 μL、1 000 μL、1 500 μL、2 000 μL、2 500 μL至 10 mL的容量瓶，加入初始流动相定容至刻度。配成浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、30 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.3.5标准曲线的绘制

将系列标准溶液分别进样，重复测定2次，结果取平均值，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并得到回归方程。

1.3.6检出限与定量限的测定

将系列标准溶液添加到不同样品中，按标准中规定的方法提取净化，进行分析，以信噪比3∶1作为检出限(LOD)，以信噪比10∶1作为定量限(LOQ)。

1.3.7回收率与精密度的测定

在4种空白样品中分别添加低、中、高3个水平的标准品，进行回收率和精密度测定。每个水平6个重复，每个样品平行测定2次，取平均值计算回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.3.84种基质中玉米赤霉烯酮含量的计算

玉米赤霉烯酮含量的计算公式如下：

X=ρ×V×1 000×f/(m×1 000)

式中：X为试样中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；ρ为试样测定液中玉米赤霉烯酮的浓度，ng/mL；V为试样测定液的最终定容体积，mL；f为稀释倍数，其中粮食和粮食制品、酱油、醋、酱及酱制品、大豆、油菜籽、食用植物油取50，酒类取25；m为试样的称样量，g。

1.3.9验证性试验

采用本文建立的HPLC-FLD方法分析小麦粉质控样品和实验室购买的四种基质的样品，平行测定2次，结果取平均值。根据峰面积和标准曲线方程，计算出样品中F-2含量。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

根据F-2浓度与峰面积的关系绘制标准曲线(图1)，F-2毒素在5～250 ng/mL范围内线性关系良好，线性方程为y=0.956 493X-1.278 46，r=0.999 6。由图2～图4可知，目标物出峰时间6.5 min左右，且峰形良好，无杂质干扰。

图1 F-2标准曲线图

图2 F-2标准品色谱图

图3 F-2样品提取液色谱图

图4 F-2样品加标色谱图

2.2 检出限与定量限

依据实验室仪器条件建立的方法对4种基质的检出限和定量限如表1所示。

表1 不同基质的检出限和定量限

检出限和定量限是评价方法适用性的重要参数，依据标准GB/T 27417[10]，方法定量限为特定基质在一定可信度内，用某一方法可靠地检出并定量被分析物的最低量，实验得出的定量限低于标准规定的定量限，说明实验室仪器和前处理设备能满足标准要求。

2.3 回收率与精密度

在4种基质中分别添加浓度为 1 μg/mL的标准储备液0.7 mL、2.0 mL、3.5 mL，得到的回收率83.20%～99.09%，6次测定的精密度为0.66%～3.00%，详细结果见表2。

表2 不同基质的回收率和精密度

2.4 验证性试验结果

对购买的小麦粉质控样品进行测定后，结果为75 μg/kg，质控标准值区间为57～79 μg/kg，结果满意(图5)。对实验室购买的小麦粉、酱油、白酒、大豆油4种产品进行测定后，均没有检出玉米赤霉烯酮。

图5 小麦粉中玉米赤霉烯酮质控样品色谱图

3 讨论

GB 5009.209—2016中规定的4种基质，不同样品的提取方式不同，前处理过程中的样品稀释倍数不同，在计算最终含量时应仔细明确各步骤中的关键点，得出正确的测定结果。标准中给出的标准曲线最大点为500 ng/mL，进样量100 μL，但在实际测定过程中，按此量注入液相色谱系统后，色谱峰扁平，出现了肩峰。根据仪器条件和色谱柱容量，保持进样量不变，将标准曲线最大点调整为250 ng/mL，按此条件得出的标准曲线线性关系良好，且所有浓度的色谱峰规整、平滑。

GB 2761—2017[3]中规定了小麦和小麦粉、玉米和玉米面中玉米赤霉烯酮的限量，对其他食品种类并没有限制，而“油脂类”的玉米赤霉烯酮含量较高[11-13]，可能是因为混合样本含有玉米油，而可能一些来源于小作坊生产或散装的玉米油产品，因原料或工艺控制不严，通常会比其他植物油含有较多的玉米赤霉烯酮。欧盟玉米油中玉米赤霉烯酮最大限量400 μg/kg，而目前我国的玉米油也有超范围的情况，所以建立我国对玉米油等其他油脂类中玉米赤霉烯酮的限量迫在眉睫，但对于小作坊生产的质量把控更是重中之重。