不同条件下臭氧溶液对牙周致病菌的体外抑制作用*

陈 岚，杨 洋，刘兴容，徐 皑△

(1.西南医科大学口腔医学院/西南医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，四川泸州 646000；2.汉中市口腔医院牙周黏膜科，陕西汉中 723000)

牙周病是混合细菌感染性疾病，由牙菌斑中的可疑致病菌通过多种机制干扰宿主防御能力而引发的牙周破坏[1]。基础治疗是牙周病治疗的基本方法[2],包括机械措施和化学方法，单纯依靠机械方式无法彻底清除菌斑，而牙周辅助应用氯己定等抗菌药物又会造成牙齿变色和短暂的味觉障碍等不良反应[3]，因此，需要新的抗菌药物用以辅助治疗牙周病。具有抗菌作用的臭氧毒副作用小，已经被应用于皮肤病[4]、骨关节炎的治疗[5]中，近年来，也以气体、水溶液、植物油的形式应用于根管消毒、口臭、下颌骨坏死、龋齿及牙周炎等的治疗中[6]。臭氧作为辅助治疗的应用代表了治疗慢性牙周炎的一种新方法[7]。本研究在前期已申请的臭氧溶液洁牙机的基础上，设计并探讨其作为牙周病辅助治疗新方法的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

标准菌株：牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,P.g)ATCC33277、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum，F.n)ATCC10957、黏性放线菌(actinomyces viscosus，A.v)ATCC 19246冻干菌株均购自四川大学重点微生物实验室。小型电解式臭氧机百特M-8600D购自百特科技环保有限公司；体视显微镜购自英国Alpha公司；显微镜购自日本OLYMPUS公司；厌氧生化培养箱厌氧培养箱购自上海跃进医疗器械厂；离心沉淀机购自广东省医疗器械厂；微量移液器购自北方同正生物技术发展有限公司；比浊仪购自上海器械厂。

1.2 方法

1.2.1臭氧溶液的制备、浓度及半衰期的测定

将臭氧机产生的臭氧以多孔砂球棒连续通入洁牙机上的无菌蒸馏水中，分别在10、15、20 ℃制备臭氧溶液，并于臭氧溶液产生后的5、10、15、20、25 min以碘量法测定溶液中的臭氧浓度及最大实验室浓度。操作重复3次，取平均值。根据回归性分析计算出各温度下臭氧溶液的半衰期。

1.2.2细菌的复苏、培养和鉴定

菌株冻存管复苏后各取50 μL划线接种于CDC血琼脂平板上，置于厌氧箱(80%N2、10%H2、10%CO2)中37 ℃厌氧培养72 h。经革兰染色镜检为纯培养后，于CDC液体培养基增菌至对数期，用比浊仪调节菌悬液密度至1.5×108cfu/mL备用。

1.2.3不同浓度、温度及作用时间下臭氧溶液的抑菌实验

实验分为3组：(1)实验组。分别于10、15、20 ℃取2.85、1.96、1.12 mg/L臭氧溶液各9 mL，共9个亚组，加入装有1 mL菌悬液的离心管中，震荡混匀，控制作用时间分别为30、60 s，取0.5 mL菌悬液，加入5 mL 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)，1 000×g离心5 min，弃上清液，再加入5 mL PBS，震荡混匀，取菌悬液0.1 mL，接种于CDC血琼脂平皿中，均匀涂布后置于37 ℃恒温培养箱培养72 h。(2)阳性对照组。取3% H2O2溶液9 mL，加入装有1 mL菌悬液的离心管中，震荡混匀，控制作用时间分别为30、60 s，取菌悬液0.5 mL，加入5 mL PBS,1 000×g离心5 min，弃上清液，再加入5 mL PBS，震荡混匀，取菌悬液0.1 mL，接种于CDC血琼脂平皿中，相同条件培养72 h。(3)阴性对照组。取无菌蒸馏水9 mL，加入装有1 mL菌悬液的离心管中，震荡混匀，控制作用时间分别为30、60 s，取菌悬液0.5 mL，加入5 mL PBS,1 000×g离心5 min，弃上清液，再加入5 mL PBS，震荡混匀，取菌悬液0.1 mL，接种于CDC血琼脂平皿中，培养相同时间。

1.2.4菌落计数

72 h时观察菌落形态，对各组菌落计数，结果取对数，记为Lgcfu/mL。实验重复3次，结果取平均值。计算各组抑菌率，抑菌率=(阴性对照组-实验组)/阴性对照组×100%。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 臭氧溶液的浓度及半衰期

在不同浓度，不同温度下的臭氧溶液均随放置时间延长浓度有不同程度的下降，水温越高分解速度越快，半衰期越短。在水温为10、15、20 ℃时臭氧溶液初始浓度分别为2.85、1.96、1.12mg/L，半衰期分别为 69.00、40.20、30.00 min。不同温度下的臭氧溶液浓度，见表1。

表1 不同温度下臭氧溶液浓度(mg/L)

2.2 细菌革兰染色结果

3株菌株经革兰染色后，镜下观察可见P.g ATCC 33277为革兰阴性球菌；F.n ATCC 10957为革兰阴性梭形杆菌，两端尖锐，中间膨大；A.v ATCC 19246为革兰阳性杆菌，多形性，不规则。形态特点均符合3种菌株的理论形态，见图1。

A：P.g ATCC33277；B：F.n ATCC10957；C：A.v ATCC19246。

2.3 臭氧溶液的体外抑菌实验结果

2.3.1臭氧溶液在不同温度、浓度、作用时间下对P.g的作用

与阴性对照组比较，各实验组臭氧溶液对P.g均具有明显的抑菌效果，臭氧溶液的浓度越高，温度越高，抑菌效果越强。臭氧溶液浓度为2.85 mg/L，温度20 ℃,作用30 s时对P.g的抑菌率最高(82.35%)，抑菌效果与3%H2O2效果相当；而浓度为1.12 mg/L，温度10 ℃，作用30 s时抑菌效果最低(23.53%)，见图2。3种浓度的臭氧溶液对P.g的抑菌结果经单因素方差分析，各组间比较差异均有统计学差异(F=28.165，P<0.01)。作用时间相同时(30、60 s)，与阴性对照组比较，9组臭氧溶液对P.g的抑菌效果抑菌整体趋势均存在明显差异(P<0.01)。与阳性对照组比较，作用30 s时，只有2.85 mg/L(15、20 ℃)差异无统计学意义(P>0.05)；作用60 s时，除2.85 mg/L(20 ℃)差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。作用浓度、温度相同，作用时间不同时，除1.96 mg/L(10 ℃)组差异有统计学差异外(P<0.05)，其余各组均差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组溶液对P.g作用30、60 s后平均菌落计数比较(Lgcfu/mL)

图2 各组溶液对P.g不同作用时间及温度下的抑菌效果

2.3.2臭氧溶液在不同温度、浓度、作用时间下对F.n的作用

与阴性对照组比较，3种浓度的臭氧溶液对F.n均有生长抑制作用，浓度越高，抑菌效果越明显。臭氧浓度为2.85 mg/L，温度为20 ℃，作用60 s时，抑菌率可达86.36%，抑制效果最强；1.12 mg/L(10 ℃)组作用30 s时抑菌率最低(42.22%)，见图3。3种浓度的臭氧对F.n的抑菌结果经单因素方差分析，各组间差异有统计学意义(F=62.22,P<0.01)。作用时间相同时，3种浓度的臭氧溶液作用30、60 s与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01);与阳性对照组比较，作用30、60 s，除2.85 mg/L组差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组均差异有统计学意义(P<0.05)。不同作用时间下，除1.12 mg/L(10 ℃)组差异有统计学意义(P<0.05)外，其余各组均差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组溶液对F.n作用30、60 s后平均菌落计数比较(Lgcfu/mL)

图3 各组溶液对F.n不同作用时间及温度下的抑菌效果

2.3.3臭氧溶液在不同温度、浓度、作用时间下对A.v的作用

与阴性对照组比较，不同浓度的臭氧溶液对A.v的生长均具有抑制作用，浓度越高，抑制作用越强。当作用浓度为2.85 mg/L，作用温度为15 ℃作用60 s时抑制作用最大，抑菌率为81.25%；浓度为1.12 mg/L，温度为10 ℃，作用30、60 s的效果一样，抑菌率最低(28.13%)，见图4。3种浓度的臭氧溶液对A.v的抑菌结果经单因素方差分析，各组间差异有统计学意义(F=19.899，P<0.01)。作用时间相同时，3种浓度的臭氧溶液作用30、60 s与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01);与阳性对照组比较，作用30 s时，各组均差异有统计学意义(P<0.05)，作用60 s时，除2.85 mg/L(15、20 ℃)组差异无统计学意义(P>0.05)外，余各组均差异有统计学意义(P<0.05)。当作用浓度、温度相同，作用时间为30、60 s时，只有2.85 mg/L(15 ℃、20 ℃)组差异有统计学意义(P<0.05)，其余差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

图4 各组溶液对A.v不同作用时间及温度下的抑菌效果

表4 各组溶液对A.v作用30、60 s后平均菌落计数比较(Lgcfu/mL)

3 讨 论

牙周病是常见的口腔感染性疾病之一，不仅损害患者的咀嚼功能，影响生活质量，还是低体重早产儿、糖尿病等[8]的重要危险因素。P.g是牙周病变区的“关键菌”，自身的菌毛促进细菌黏附和生物膜的形成，脂多糖引发炎症，干扰宿主的免疫反应[9]；F.n是菌斑生物膜中最丰富的物种，也是作为口腔早期和晚期定植细菌之间的桥梁细菌，促进了牙菌斑的形成[10]。A.v是与根面龋和牙周病相关的一种常见的革兰阳性菌，通过黏附素在牙齿表面上黏附和定植，加速菌斑的形成和沉积[11]，加重牙周病的进展。这3种牙周致病菌均参与牙龈炎和牙周炎的发生、发展，导致牙周组织的破坏，因此，选取此3种菌作为本研究的实验对象。

臭氧具有强大的氧化性，低浓度臭氧就可以通过氧化磷脂和脂蛋白破坏细菌包膜的完整性，破坏葡萄糖氧化酶、RNA、蛋白质等[12]，从而干扰细菌代谢，阻碍细菌的生长繁殖，发挥杀菌抑菌的作用。臭氧相较于其他抗菌药物，具有无耐药性产生，无局部刺激等特性，有学者将臭氧应用于牙周病治疗并取得一定的疗效。NARDI等[13]将确诊为牙周炎的96例患者，随机分为实验组和对照组，实验组刮治后使用臭氧化橄榄油漱口水，对照组仅完成刮治，3个月后发现实验组患者的探诊出血和唾液金属蛋白酶-8得到了更明显的改善。在25例完成龈下刮治的中度至重度慢性牙周炎病例中，以臭氧橄榄油和氯己定作为辅助冲洗治疗，结果臭氧橄榄油组改善牙周病的菌斑效果与氯己定相当[14]。但也有研究在牙周治疗期间，以气态臭氧作用于牙周袋内，2周后发现臭氧相比于对照组无明显的促进作用[15]。随着研究的深入，不同形式的臭氧应用于牙周病的辅助治疗，然而气态臭氧的使用需要密闭空间，长时间的吸入可能会引起鼻炎、咳嗽、头痛甚至恶心、呕吐[6]，臭氧化油作为一种抗菌缓释剂，发挥广泛的抗菌作用的同时会产生难闻的气味，再加上其黏性高[16]，不适合作为冲洗液。相较之下，液态臭氧具有使用方便，稳定性高和毒副作用少等优点。本研究证实了在不同条件下臭氧溶液对几种牙周致病菌均有抑制作用，只是最适抑菌条件不一样，针对不同细菌，选择适宜的温度，作用时间适当的延长，可以增强臭氧溶液的抑菌效果。临床上如果能将臭氧发生器与洁牙机结合使用，通过时间模块，温度模块，浓度模块的设定，可达到制备出不同浓度、温度、作用时间的臭氧溶液的目的，针对牙周袋内特定的优势菌采用特定臭氧溶液辅助治疗，以取得更好的杀菌效果，并省去了牙周袋内辅助给药的治疗步骤。然而臭氧溶液作为临床洁牙的冲洗液达到牙周病的辅助治疗效果究竟如何，还需要更多高质量的临床实验研究来证明。

本实验通过臭氧溶液对3种牙周致病菌在体外不同条件下的抑菌效果研究，得出以下结论：(1)在温度设定为10、15、20 ℃时臭氧溶液初始浓度分别为2.85、1.96、1.12 mg/L，半衰期分别为 69.00、40.20、30.00 min；(2)3种浓度的臭氧溶液在3种温度下对3种牙周致病菌作用30、60 s均有抑制作用；(3)当温度设定在20 ℃、浓度2.85 mg/L，作用30 s时对P.g生长抑制作用最强；(4)当温度设定在20 ℃、浓度2.85 mg/L，作用60 s时对F.n的抑制作用最强；(5)当温度设定在15 ℃、浓度为2.85 mg/L，作用60 s时对A.v抑菌性最强。