circ_0062389通过靶向miRNA-331-3p对ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响及其机制研究*

曹俊杰，黄 剑，刘占鳌，霍桂军，汤 尧

[南京医科大学姑苏学院/南京医科大学附属苏州医院/苏州市立医院(本部)血管外科，江苏苏州 215002]

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的病理基础，极大威胁人类生命健康。血管内皮细胞是维持血管壁结构和功能的重要屏障，其损伤是AS发生的始动环节[1]。因此，抑制或减轻血管内皮细胞损伤是预防和治疗AS的重要途径。环状RNA(circRNA)是一类非编码RNA，可作为微RNA(microRNA，miRNA)分子海绵发挥作用，调控miRNA靶基因的表达，进而影响细胞生理或病理过程，参与人类多种疾病的发展进程[2-4]。研究显示，circ_0062389在心力衰竭大鼠心肌组织中高表达，沉默其表达可明显降低大鼠心肌细胞凋亡，改善大鼠心肌功能，其作用机制与调控转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/SMAD家族成员3(Smad3)信号通路有关，有可能成为治疗心力衰竭的分子靶点[5]。但目前，circ_0062389对AS发生、发展的影响和机制还不清楚。Circular RNA Interactome靶基因在线软件预测显示，circ_0062389可能竞争性结合miRNA-331-3p。ZHANG等[6]研究显示，脊髓损伤大鼠脊髓中miRNA-331-3p表达下调，miRNA-331-3p过表达可改善脊髓损伤大鼠运动能力，减轻脊髓组织损伤、神经元凋亡和炎性反应，可用作治疗脊髓损伤的分子靶点。而目前miRNA-331-3p对AS发生、发展的影响还不清楚,因此，本研究通过建立氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)诱导的血管内皮细胞损伤模型，观察circ_0062389和miRNA-331-3p对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及circ_0062389可否通过调控miRNA-331-3p发挥作用，以期为AS的治疗提供分子靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞：人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)，购自上海弘顺生物科技有限公司。试剂：改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified EagleMedium,DMEM)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒，购自北京索莱宝公司；LipofectamineTM2000试剂盒，购自美国Invitrogen公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，购自浙江天杭州生物科技股份有限公司；circ_0062389小干扰RNA(si-circ_0062389)、小干扰RNA阴性序列(si-NC)、miRNA-331-3p抑制剂(anti-miRNA-331-3p)、抑制剂阴性序列(anti-miRNA-NC)、miRNA-331-3p 模拟物(mimics)、模拟对照序列(miRNA-NC)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)引物，均购自上海生工生物工程有限公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；兔抗人活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3和cleaved-caspase9单克隆抗体，购自美国Santa Cruz公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养和转染

复苏HUVEC，用含10% FBS的DMEM培养液培养。取对数期HUVEC，将其接种至6孔板中(1.0×105个/孔)，培养12 h后弃培养液。采用LipofectamineTM2000脂质体法，分别转染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共转染si-circ_0062389与anti-miRNA-NC、si-circ_0062389与anti-miRNA-331-3p，转染12 h后更换新鲜培养液，再培养24 h后，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测细胞中circ_0062389或miRNA-331-3p表达验证转染效果，并收集细胞备用。

1.2.2细胞分组处理

将未转染、转染后的HUVEC均接种至6孔板中(1.0×105个/孔)，培养12 h后弃培养液。未转染的HUVEC分为对照组(Con组)和ox-LDL组，Con组细胞用常规培养液培养24 h，ox-LDL组细胞用含ox-LDL终浓度为100 μg/mL[7]的培养液培养24 h。转染si-NC、si-circ_0062389、miRNA-NC、miRNA-331-3p mimics、共转染si-circ_0062389与anti-miRNA-NC、si-circ_0062389与anti-miRNA-331-3p的细胞均用含ox-LDL终浓度为100 μg/mL的培养液培养24 h，并依次记为 ox-LDL+si-NC组(A组)、ox-LDL+si-circ_0062389组(B组)、ox-LDL+miRNA-NC组(C组)、ox-LDL+miRNA-331-3p组(D组)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-NC组(E组)、ox-LDL+si-circ_0062389+anti-miRNA-331-3p组(F组)。培养结束后，收集各组细胞并用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)清洗2次，然后检测以下指标。

1.2.3RT-qPCR检测circ_0062389和miRNA-331-3p表达

用RNA抽提试剂盒提取各组HUVEC中总RNA，经逆转录生成cDNA后，行PCR扩增。扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。引物序列：circ_0062389上游5′-GTA CGA GAT GAG TCG ACG CGC-3′，下游5′-CGA TAG GCG CGA GCG AGC-3′；miRNA-331-3p上游5′-TCG GCA GGG CCC CTG GGC CTA-3′，下游5′-GCC CCU GGG CCU AUC CUA GAA-3′；GAPDH上游5′-GTT GGA GGT CGG AGT CAA CGG-3′，下游5′-GAG GGA TCT CGC TCC TGG AGG A-3′；U6上游5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游5′-CGC TTC AGA ATT TGC GTG TCA T-3′。2-ΔΔCt法计算circ_0062389 相对于GAPDH、miRNA-331-3p相对于U6的表达水平。

1.2.4酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HUVEC中MDA水平及SOD和GSH-Px活性

向HUVEC中加入细胞裂解液，充分裂解细胞，3 500 r/min离心5 min，取上清液，分别参照MDA、SOD和GSH-Px试剂盒，检测上清液中其表达水平。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡

向各组HUVEC中加500 μL结合缓冲液，将细胞重悬。然后利用Annexin V-FITC/PI试剂盒，依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6Western blot检测cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达

将各组HUVEC中加放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)试剂，充分裂解细胞，提取细胞中总蛋白。将蛋白溶液经BCA法定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、转膜及封闭后，分别置于cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液，在4 ℃冰箱中孵育过夜。洗膜后置于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中，在37 ℃摇床中孵育1 h。洗膜后加显影液避光显影，凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析cleaved-caspase3和cleaved-caspase9相对于GAPDH表达水平。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验

根据Circular RNA Interactome靶基因在线软件预测circ_0062389与miRNA-331-3p核苷酸序列的结合位点，分别构建circ_0062389野生型荧光素酶载体(WT-circ_0062389)及突变型荧光素酶载体(MUT-circ_0062389)，该过程由上海生工生物工程有限公司设计并完成。将HUVEC接种至6孔板中(1.0×105个/孔)，用LipofectamineTM2000脂质体法，分别将WT-circ_0062389和miRNA-NC、WT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic、MUT-circ_0062389和miRNA-NC、MUT-circ_0062389和miRNA-331-3p mimic共转染至HUVEC中。转染12 h后，更换新鲜培养液，再培养24 h收集细胞，加细胞裂解液裂解，3 500 r/min离心5 min，取上清液，参照荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾荧光强度的比值表示。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 ox-LDL组与Con组HUVEC中circ_0062389和miRNA-331-3p表达水平比较

ox-LDL组HUVEC中circ_0062389表达水平高于Con组(3.01±0.29vs.1.00±0.00，t=20.79，P<0.01)，而miRNA-331-3p表达水平低于Con组(0.33±0.03vs.1.00±0.00，t=67.00，P<0.01)。

2.2 各组HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比较

B组HUVEC中circ_0062389表达低于A组(0.23±0.03vs.1.00±0.00，t=77.00，P<0.01)。与Con组比较，ox-LDL组HUVEC中MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。与A组比较，B组HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)。ox-LDL组与A组各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组HUVEC中MDA水平及SOD、GSH-Px活性比较

2.3 各组HUVEC中凋亡相关蛋白表达水平比较

ox-LDL组HUVEC中细胞凋亡率高于Con组[(30.38±3.45)%vs.(5.14±0.43)%,P<0.05]，凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平高于Con组(P<0.05)。A、B组HUVEC中细胞凋亡率分别为(32.57±3.17)%、(10.14±0.84)%，与A组比较，B组HUVEC中细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；且凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平均低于A组(P<0.05)。ox-LDL组与A组各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1、2。

a:P<0.05,与Con组比较；b:P<0.05，与A组比较。

2.4 Circular RNA Interactome靶基因在线软件预测circ_0062389与miR-331-3p核苷酸序列的结合位点

Circular RNA Interactome靶基因在线软件预测显示，circ_0062389与miRNA-331-3p的核苷酸序列存在结合位点，见图3。双荧光素酶报告基因结果显示，共转染miRNA-331-3p mimics和WT-circ_0062389的HUVEC荧光素酶活性较共转染miRNA-NC和WT-circ_0062389的细胞明显降低(0.52±0.04vs.0.96±0.07，t=16.37，P<0.01)，但共转染miRNA-331-3p mimics和MUT-circ_0062389的HUVEC荧光素酶活性与共转染miRNA-NC和MUT-circ_0062389的细胞比较差异无统计学意义(0.99±0.07vs.0.98±0.08，t=0.28，P=0.78)。同时，转染si-circ_0062389的HUVEC中miRNA-331-3p表达明显高于转染si-NC的细胞(3.01±0.28vs.1.03±0.06，t=20.74，P<0.01)。

图2 各组HUVEC细胞凋亡流式图

图3 circ_0062389的序列中含有与miRNA-331-3p互补的核苷酸序列

2.5 C、D组HUVEC细胞损伤相关指标比较

D组HUVEC中miRNA-331-3p表达高于C组细胞(3.79±0.31vs.1.00±0.00，t=27.00，P<0.01)。与C组比较，D组HUVEC中MDA水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性升高(P<0.05)，细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平均降低(P<0.05)，见表2、图4。

A:Western blot检测；B：蛋白相对表达水平柱状图；C、D：细胞凋亡流式图；a:P<0.05,与C组比较。

表2 C、D组HUVEC细胞损伤相关指标比较

2.6 E、F组HUVEC细胞损伤相关指标比较

F组HUVEC中miRNA-331-3p表达低于E组细胞(0.26±0.02vs.1.00±0.00，t=111.00，P<0.01)。与E组比较，F组HUVEC中miRNA-331-3p表达水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)，细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平均升高(P<0.05),见图5、表3。

A:Western blot检测；B：蛋白相对表达水平柱状图；C、D：细胞凋亡流式图；a:P<0.05,与E组比较。

表3 E、F组HUVEC细胞损伤相关指标比较

3 讨 论

ox-LDL是重要的致病因子，其可诱导血管内皮细胞产生过度氧化应激反应及细胞凋亡，促进AS的发生、发展过程[8]。本研究显示，HUVEC经100 μg/mL ox-LDL干预24 h后，细胞中氧化应激指标MDA表达明显增加，SOD和GSH-Px活性明显降低，且细胞凋亡率升高，与相关报道结果一致[9]，说明ox-LDL诱导HUVEC产生了氧化应激反应，且加剧了HUVEC凋亡，ox-LDL诱导的HUVEC损伤模型建立成功。

circRNA呈闭合环状结构，可通过竞争性结合miRNA，影响miRNA靶基因的表达，进而发挥生物学功能。研究显示，circRNA参与调控血管内皮细胞功能障碍，可作为减轻血管内皮细胞损伤的分子靶点。如PENG等[10]研究显示，circ-USP36可通过靶向miRNA-98-5p/VCAM1轴促进ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡及炎性反应，减轻血管内皮细胞损伤，其有望成为治疗AS的分子靶点；QIN等[11]研究显示，circ_0003645的沉默可减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡及炎症损伤，对揭示AS的发病机制及治疗靶点的选择提供了新途径。探究影响AS血管内皮细胞损伤的分子机制可为其治疗提供新靶点。

circ_0062389是circRNA家族成员之一，可靶向miRNA-103a-3p/CCNE1轴促进非小细胞肺癌的发展进程，为非小细胞肺癌的治疗提供了新策略[12]。本研究结果显示，circ_0062389在ox-LDL诱导的HUVEC中表达升高，敲减其表达可明显减少ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡，提示circ_0062389可能成为降低ox-LDL诱导的HUVEC细胞损伤的分子靶点。细胞凋亡受多种基因分子调控，其中caspase级联反应对细胞凋亡发挥重要调控作用[13]。caspase9是caspase级联反应的起始分子，再接受到上游凋亡信号后被活化，向下游传递凋亡信号。caspase3处于caspase级联反应的核心位置，其被活化后，执行细胞凋亡。本研究结果提示，circ_0062389可能通过间接抑制caspase级联反应来减少ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。

ox-LDL引起的血管内皮细胞氧化应激是血管内皮细胞损伤的主要通路，抑制ox-LDL诱导的氧化应激可保护血管内皮细胞免受氧化损伤[14]。MDA是脂质过氧化产物之一，细胞中其水平越高，说明氧化应激反应越剧烈。SOD是机体内重要的抗氧化酶，其可清除氧自由基，减轻机体组织损伤。GSH-Px也是抗氧化酶，与SOD具有协同作用，对机体组织发挥保护作用。本研究显示，敲减circ_0062389通过降低ox-LDL诱导的HUVEC中MDA表达及提高SOD和GSH-Px活性减轻细胞氧化损伤。

为了进一步探究敲减circ_0062389抑制ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激和凋亡的分子机制，本研究证实了circ_0062389可靶向结合并负调控miRNA-331-3p，这与本文ox-LDL促进HUVEC中circ_0062389的表达而抑制miRNA-331-3p表达的结果一致。有研究显示，miRNA-331-3p在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)患者血清中表达降低，且与AD患者简易智能精神状态量表(mini-mental state examination,MMSE)评分和血清促炎细胞因子的表达密切相关，是诊断AD的潜在生物标志物；过表达miRNA-331-3p可提高β-淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)1-40诱导的神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞活性，并抑制细胞炎性损伤，miRNA-331-3p具有潜在的神经保护作用[15]。本研究结果显示，miRNA-331-3p过表达明显减轻了ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激水平，并减少了细胞凋亡，提示miRNA-331-3p可作为AS治疗的分子靶点。此外，本研究实验结果还显示，敲减miRNA-331-3p逆转敲减circ_0062389对ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激及凋亡的抑制作用，进一步提示circ_0062389可能通过靶向负调控miRNA-331-3p来影响ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激和凋亡，但其具体调控的miRNA-331-3p靶基因还有待进一步探究。

综上所述，ox-LDL促进HUVEC中circ_0062389的表达，而抑制miRNA-331-3p表达；circ_0062389可能通过靶向抑制miRNA-331-3p来促进ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激及凋亡，其可能成为AS治疗的分子靶点。