丁苯酞对慢性低O2高CO2大鼠脑内线粒体凋亡和自噬的影响*

闵晶晶，陈 琪，顾 群，王小同

(1.浙江省湖州市第一人民医院神经内科 313000；2.浙江省湖州市第一人民医院肾内科 313000；3.温州医科大学附属第二医院康复科，浙江温州 325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系统的常见多发病，以不完全可逆的气流受限为特征。COPD并不单纯表现为肺部症状，还可以继发多个脏器的损害，特别是COPD患者的认知障碍问题已引起广泛关注[1-3]。慢性低氧高二氧化碳(低O2高CO2)是COPD发生、发展的重要病理机制之一，在前期的研究中也发现慢性低O2高CO2模型下大鼠存在着不同程度的学习记忆障碍[4-5]。有研究表明，神经元细胞的凋亡与低氧环境诱发的认知障碍密切相关[6-7]。自噬是真核细胞溶酶体介导的细胞内成分的自我降解过程[8-9]，近来的研究表明，自噬的缺陷导致蛋白质突变或折叠错误,是许多神经退行性疾病发生和发展的基础[9-10]。丁苯酞软胶囊是我国第一个拥有自主知识产权的国家一类化学新药，目前已被广泛应用于缺血性脑卒中的治疗，具有重构缺血区微循环，保护线粒体功能和抑制细胞凋亡等作用[11-14]。本实验通过建立低O2高CO2大鼠模型，观察大鼠学习记忆能力及线粒体凋亡、自噬的表达情况，并通过丁苯酞软胶囊的干预来观察其是否对此模型下大鼠具有神经保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

低O2高CO2氧舱购自长沙华曦电子科技有限公司；Morris水迷宫购自北京硕林苑科技有限公司；原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)试剂盒购自罗氏公司(Roch,批号11684817910)；抗B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell CLL/lymphoma 2,Bcl-2)关联X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)、抗自噬相关蛋白酵母ATG6同源物(The mammalian ortholog of yeast autophagyrelated gene 6,Beclin-1)、抗自噬标记蛋白-微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-assaiated protein l light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司(批号：2722、9664、3495、2775)；Bcl-2、抗腺病毒E1B 19-kD相互作用蛋白3(Bcl-2/E1B 19 kDa interacting protein 3,BNIP3)、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)均购自英国Abcam公司(批号：ab194583、ab10433、ab8345)；抗低氧诱导因子-1α亚基(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)购自美国Novus Biologicals公司(批号：NB100-105)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜购自美国Millipore(批号：IPVH 00010)。电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)发光液、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔二抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗均购杭州自弗德生物科技有限公司(批号：FD8020、FDR007、FDM007)。

1.2 方法

1.2.1造模分组

64只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性SD大鼠，体重200～230 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[编号:SCXK(沪)2017-0005]。将64只大鼠分为4组，每组各16只：即对照组、模型组、植物油组、丁苯酞组。参照李勇等[15]的造模方法，将模型组、植物油组、丁苯酞组大鼠置于常压低O2高CO2舱内进行造模，通过N2降低模型舱内O2浓度，使舱内O2浓度维持在9.0%～11.0%，CO2浓度维持在5.0%～6.0%，每天造模8 h，共造模2周，每周6 d；其余时间与对照组一起置于正常环境中(室温20～23 ℃，相对湿度50%～70%)饲养，饲养期间大鼠可自由获得食物和饮水，丁苯酞软胶囊80 mg/kg或相同剂量的植物油在每天造模结束后进行灌胃，持续2周，每周6 d。

1.2.2Morris水迷宫实验

连续训练5 d，每天接受3次试验，前2 d如果大鼠在60 s的时间内没有找到平台，将其轻轻地引导至平台并在平台上休息30 s，第3天开始不再引导，未找到者记录潜伏期为60 s。在第6天的空间平台搜索实验中，将平台从池中移出，并让老鼠游泳60 s，记录穿越平台的次数。

1.2.3TUNEL法检测组织细胞凋亡

将石蜡切片用蒸馏水洗涤并在37 ℃用蛋白质消化酶处理20 min，然后根据罗氏的TUNEL试剂盒说明书进行原位细胞凋亡的检测，观察海马CA1区的凋亡细胞并计算百分比。

1.2.4透射电镜观察自噬情况

取海马切成 1 mm3的小块，戊二醛磷酸缓冲液固定，常规脱水、浸透、包埋、染色，制成超薄的切片,在透射电镜下观察。

1.2.5Western blot检测蛋白水平

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离等量的蛋白质并转移至PVDF膜，在室温下用5%无脂奶粉将PVDF膜封闭2 h。然后将膜与各自的一抗在4 ℃温育过夜，TBS Tween 20 Buffer(TBST缓冲液)洗膜5 min×6次，加HRP标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜5 min×6次，用ECL发光液(试剂A∶试剂B=1∶1)覆盖膜(每张约60 μL)，曝光后进行分析计算。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠定位航行实验相关指标及穿越平台次数比较

在Morris水迷宫训练的第1、2天，各组大鼠在逃避潜伏时间上比较，差异无统计学意义(P>0.05)。第3、4、5天，与对照组比较，模型组和植物油组的潜伏期明显延长(P<0.05)；与模型组比较，丁苯酞组大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。第4、5天的游泳距离也出现类似趋势。在最后一天的穿越平台次数试验中，各组大鼠穿越平台次数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1～2、图1。

表1 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期时间和穿越平台次数比较

表2 各组大鼠定位航行实验游泳距离比较

图1 各组大鼠游泳路线图

2.2 丁苯酞软胶囊干预对于模型大鼠凋亡的影响

Western blot检测抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、caspase-3水平显示，模型大鼠造模2周后出现了Bcl-2、Bax以及caspase-3表达的增加，丁苯酞软胶囊的干预抑制了Bax、caspase-3的增加，进一步促进了Bcl-2的表达(P<0.05)。TUNEL检测显示，模型组大鼠凋亡细胞增加，丁苯酞组较模型组凋亡细胞明显减少(P<0.05)。各组大鼠凋亡相关蛋白表达水平及凋亡率比较，见表3和图2、3。

A:对照组;B:模型组;C:植物油组;D:丁苯酞组。

表3 各组大鼠凋亡相关蛋白相对表达水平及凋亡率比较

2.3 丁苯酞软胶囊干预对于模型大鼠对线粒体自噬的影响

通过透射电镜检查结果显示，慢性低O2高CO2模型下存在着自噬体的表达，导致线粒体结构破坏，线粒体空泡比，嵴断裂或溶解，细胞内自噬体增加。并且在丁苯酞干预后自噬体的数量进一步增加(图4)。Western blot检测显示，模型下存在着HIF-1α的激活，BNIP3表达的上调及自噬标志物Beclin-1和LC3Ⅱ表达的增加，在使用丁苯酞干预后，HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白的表达较模型组进一步增加(P<0.05)，见图5、表4。

A:对照组;B:模型组;C:植物油组;D:丁苯酞组。

A:对照组;B:模型组;C:植物油组;D:丁苯酞组。

A:对照组;B:模型组;C:植物油组;D:丁苯酞组。

表4 各组大鼠自噬相关蛋白相对表达水平比较

3 讨 论

COPD患者伴发的认知障碍给社会和家庭带来了较大的负担，慢性低O2高CO2是COPD发生、发展的重要病理生理机制之一。本研究中采用了慢性低O2高CO2模型来评估丁苯酞软胶囊对此模型下大鼠认知障碍的保护作用。通过Morris水迷宫实验发现，在慢性低O2高CO2暴露下，大鼠存在着明显的学习记忆障碍，并且伴有线粒体促凋亡蛋白、自噬表达的增加及抗凋亡蛋白表达的减少，而在使用丁苯酞软胶囊干预后大鼠逃避潜伏期和定位航行游泳距离明显缩短，学习记忆水平明显提高，同时大鼠海马CA1区伴有线粒体自噬水平的增加和线粒体凋亡水平的下降。但在Morris水迷宫中，各组大鼠穿越平台次数比较差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与水迷宫的直径远远大于平台直径，目标平台太小有关。

线粒体是细胞进行有氧呼吸的场所，它一方面通过氧化磷酸化为细胞提供能量，另一方面参与启动线粒体的凋亡途径。Bcl-2是一种存在于线粒体外膜中的抗凋亡蛋白，通常与Bax形成异源二聚体来抑制细胞凋亡的激活。Bax是一种位于细胞质中的线粒体抗凋亡蛋白，正常情况下无活性，当凋亡时被触发，Bax与自身形成同源二聚体并从细胞质中移位线粒体外膜，启动凋亡途径。在caspase家族中，caspase-3被认为是凋亡级联反应的最终执行者[16-18]。有学者在血管性痴呆大鼠身上发现丁苯酞对血管性痴呆大鼠的记忆能力有明显改善作用,认为与其抑制caspase-3过度表达，抑制细胞凋亡,促进细胞存活有关[19]。而本研究在慢性低O2高CO2模型大鼠脑内发现了caspase-3表达的增加同时伴随促凋亡蛋白Bax增加及抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，但在使用丁苯酞干预后Bax、caspase-3表达明显减少，而Bcl-2表达进一步增加，说明丁苯酞软胶囊在此模型下可能通过调节抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白之间的平衡从而发挥一定的抗凋亡作用。

线粒体自噬是指应激条件下细胞通过自噬选择性地清除损伤或多余线粒体的过程,对维持细胞稳态具有重要作用[19-20]。LC3是酵母细胞基因Atg-8的同源体[20],自噬泡的形成以LC3Ⅱ从细胞膜的外表面释放为标志，LC3Ⅱ表达的增加通常被认为是自噬发生的金标准。Beclin-1是启动自噬小体形成的关键蛋白，其为酵母Atg-6基因的同源体[20]。当细胞处于低氧状态时，HIF-1 是低氧应激的关键调控者，HIF-1α是HIF-1的一个亚基，受氧浓度的调节[21]。有学者发现，低氧条件下HIF-1α介导了 BNIP 和 BNIP3L 表达，诱导线粒体自噬的发生从而防止细胞凋亡[21]。BNIP3 和 BNIP3L(NIX)是同源基因，二者与Beclin-1具有相同的BH3结构域，均可竞争性地把Beclin-1从Bcl-2或Bcl-xl的结合复合物中游离出来，从而促进线粒体自噬的发生[21]。有研究者在对BNIP3基因敲除鼠及野生大鼠的缺血缺氧动物模型研究，对基因敲除大鼠皮层神经元进行氧糖剥夺处理，发现NIX/BNIP3L 表达上调，凋亡减弱，自噬增强，大脑梗死灶体积变小[22]。本课题组在慢性低O2高CO2模型下发现了自噬体的存在及HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达，而在使用丁苯酞软胶囊干预后自噬体的数量较前增加，上述蛋白的表达较前明显提高，说明丁苯酞软胶囊可能在慢性低O2高CO2条件下通过线粒体自噬水平的进一步提高从而改善大鼠的认知障碍。

本研究表明，慢性低O2高CO2可导致大鼠空间学习记忆障碍，诱导凋亡和线粒体自噬表达，丁苯酞可能通过提高线粒体自噬水平同时降低凋亡水平来改善慢性低O2高CO2导致的大鼠空间学习记忆障碍，从而发挥神经保护作用。