基于IL-17/Notch轴土茯苓总黄酮对银屑病小鼠皮肤瘙痒缓解及炎症反应抑制的作用机制研究*

王秀菊，周丽娟，王康民，于小璇，田中伟

（1.郑州颐和医院皮肤科，郑州 450047；2.郑州市中心医院皮肤科，郑州 450000；3.新乡医学院第一附属医院皮肤科，新乡 453100）

银屑病是一种慢性炎症性疾病，其主要特征为皮肤出现鳞屑和红斑，主要病理表现为淋巴细胞浸润，角质细胞异常增生以及细胞因子分泌异常等[1]，皮肤瘙痒是银屑病患者常见症状，多于夜间发生，严重影响患者的睡眠质量，目前，对于其发生机制尚不明确。土茯苓是一种传统中药，记载于《本草纲目》，具有清热解毒、除湿等作用。研究表明，中药银屑病一号方（其中含土茯苓15 g）治疗血热型银屑病，可减轻患者炎症反应，且疗效显著，具有较高安全性[2]。土茯苓总黄酮是从土茯苓提取物中分离纯化得到的活性成分，具有多种药理学活性，研究表明，土茯苓总黄酮能改善单侧输尿管梗阻大鼠肾功能障碍，减轻肾间质纤维化[3]。研究发现，Notch信号通路与银屑病角质细胞过度增生及凋亡、炎性细胞浸润密切相关[4]。研究表明，miR-25b通过抑制Notch信号通路，可促进角质细胞凋亡，抑制细胞增殖能力[5]。黄葵总黄酮通过抑制Notch信号通路对IgA肾病具有治疗作用[6]。基于以上研究，本研究建立银屑病小鼠模型，探讨土茯苓总黄酮通过Notch信号通路对银屑病小鼠的炎症抑制作用及对皮肤瘙痒症状的改善作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性BALB/c小鼠8周龄，20～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2017-0011，适应性饲养3 d后用于实验。

1.2 试剂和仪器 土茯苓购自浙江中医药大学中药饮片厂，将土茯苓饮片烘干，磨碎后过筛，60℃下用60%乙醇以1∶20料液比提取3 h，收集提取液，蒸至无乙醇后，加入正丁醇萃取，再次旋蒸至无正丁醇，冷冻干燥后备用。

1.3 模型制备及给药 将50只小鼠腹腔麻醉，背部2 cm×3 cm长方形区域脱毛，按照随机数字表法将小鼠随机分为正常组、模型组、土茯苓总黄酮低剂量组（简称低剂量组）、土茯苓总黄酮高剂量组（简称高剂量组）和甲氨蝶呤组，每组10只。除正常组外，其余组小鼠脱毛区域每天涂抹5%咪喹莫特软膏62.5 mg，1次/日，连续7 d，正常组小鼠用等量凡士林涂抹，与此同时，每日下午17点，低剂量组小鼠以300 mg/kg土茯苓总黄酮灌胃，高剂量组小鼠以500 mg/kg土茯苓总黄酮灌胃，甲氨蝶呤组小鼠以1 mg/kg甲氨蝶呤片水溶液灌胃，每日1次，连续7 d，正常组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水[7]。造模成功标准[8]：出现与人类银屑病相似的特征，肉眼可见暗红斑块，基底浸润，表面有干燥鳞屑，病理切片可见角质增厚，主要表现为角化不全，颗粒层变薄，棘层明显增厚，嗜中性粒细胞浸润。

1.4 评估小鼠皮肤瘙痒情况 分别在第1、3、5和7天，计数小鼠在1 h内的抓挠次数评估皮肤瘙痒程度，每日早上7时，将小鼠置于一个透明的观察笼中，待小鼠安静后持续拍摄1 h，计数小鼠抓挠次数，以小鼠后爪离地，对背部涂抹部位进行抓挠，后爪落地或舔、撕咬后爪记为1次抓挠。抓挠其他未涂咪喹莫特软膏的部位皮肤不计数。

1.5 皮损严重程度指数（PASI）评分 从小鼠皮损部位的红斑、表皮脱屑及浸润情况3个方面进行PASI评分：皮损部位与正常皮肤齐平，无红斑、无表皮脱屑，记为0分；皮损部位稍高于正常皮肤，出现淡红色斑、少许表皮脱屑则为轻度皮损，记为1分；皮损部位中度隆起，可见红色斑块、且覆有片状的表皮脱屑则为中度皮损，记为2分；皮损部位明显隆起，可见深红色斑块，且皮损表面有较厚呈层状的表皮脱屑则为重度，记为3分；皮损处可见明显增厚的隆起，极深红色斑块、且表面覆盖有厚实呈层状的表皮脱屑则为极重度，记为4分。总分为红斑+表皮脱屑+斑块厚度的总和[9]。

1.6 ELISA检测血清 IFN-γ、IL-23和 TNF-α含量 颈椎脱臼法处死所有小鼠，取皮损处皮肤用于以下实验，打开胸腔，主动脉采血，3 000 r/min，离心半径为8 cm，离心10 min，取上清液，为待测样品。取出酶标板，设置标准孔和待测样品孔，将100 μL标准品或待测样品加入相应的孔中，混匀，37℃恒温箱中孵育2 h，各孔加入300 μL洗涤液，洗5次，甩干、拍板，加入100 μL生物素抗体工作液，37℃孵育2 h，洗板，加入100 μL酶结合物工作液，37℃孵育2 h，洗板 5次，加入显色剂100 μL，闭关显色30 min，加入终止液 100 μL，反应 5 min，置于酶标仪上，450 nm波长处测定吸光度（A）值。

1.7 HE染色观察小鼠皮损处皮肤的病理损伤情况 取部分皮损处皮肤，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脱水、石蜡包埋、切片（片厚 4 μm），烘片，行HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察皮肤病理损伤情况。

1.8 荧光定量-PCR（qRT-PCR）法检测皮损部位皮肤组织中AQP3和Cer mRNA相对表达量 取部分皮肤组织置于液氮中研磨，加入Trizol试剂提取组织中的总RNA，根据逆转录试剂盒说明将800 ng RNA逆转录成cDNA，取1 μL cDNA为模板，上下游引物各0.7 μL，进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s，进行40个循环，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用 2-ΔΔCT方法计算 AQP3和Cer基因mRNA相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.9 蛋白印迹法检测皮肤组织中IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量 取100 mg皮损部位的皮肤组织，液氮中研磨后，加入1 mL裂解液，置于冰上静置30 min，4℃12 000 r/min，离心半径为10 cm，离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，100℃煮沸。120 V电泳2 h，0.3 A湿转2 h，TBST 洗膜，室温封闭 1 h，GAPDH、IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h，TBST 洗膜，ECL法曝光，Image J分析条带灰度值，目标蛋白条带灰度值/内参条带灰度值为目标蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）描述，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤瘙痒情况评估 造模后第1天，抓挠次数组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后第3、5和7天，抓挠次数组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组小鼠抓挠次数增多（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠抓挠次数减少（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠抓挠次数减少（P＜0.05）；与高剂量组比较，甲氨蝶呤组小鼠抓挠次数减少（P＜0.05）。见表2。

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表2 各组小鼠抓挠次数比较（±s）Tab.2 Comparison of scratching times of mice in each group（±s） 次

表2 各组小鼠抓挠次数比较（±s）Tab.2 Comparison of scratching times of mice in each group（±s） 次

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数 第1天 第3天 第5天 第7天正常组 10 11.20±3.47 12.52±2.73 11.57±4.02 13.43±5.11模型组 10 12.64±4.05 92.46±5.20* 133.84±7.28* 185.77±9.38*低剂量组 10 11.38±3.22 75.44±3.69*# 106.94±6.03*# 143.46±8.29*#高剂量组 10 13.40±3.17 43.25±4.32*#△ 81.57±5.42*#△ 110.30±8.10*#△甲氨蝶呤组 10 12.06±2.84 29.86±3.23*#△▲ 50.30±4.64*#△▲ 84.27±6.63*#△▲

2.2 各组小鼠皮损PASI评分比较 各组小鼠PASI评分组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组 PASI评分升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组和甲氨蝶呤组PASI评分降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和甲氨蝶呤组 PASI评分降低（P＜0.05）；与高剂量组比较，甲氨蝶呤组PASI评分降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠PASI评分比较（±s）Tab.3 Comparison of PASI score of mice in each group（±s） 分

表3 各组小鼠PASI评分比较（±s）Tab.3 Comparison of PASI score of mice in each group（±s） 分

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数 PASI评分正常组 10 0.21±0.08模型组 10 6.89±1.03*#低剂量组 10 5.52±1.02*#高剂量组 10 4.05±1.27*#△甲氨蝶呤组 10 2.58±1.24*#△▲

2.3 各组小鼠炎症因子检测结果比较 各组小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组 IFN-γ、IL-23和TNF-α含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组和甲氨蝶呤组IFN-γ、IL-23和TNF-α含量降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和甲氨蝶呤组IFN-γ、IL-23和 TNF-α含量降低（P＜0.05）；与高剂量组比较，甲氨蝶呤组 IFN-γ、IL-23和 TNF-α 含量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量比较（±s）Tab.4 Comparison of the content of IFN-γ，IL-23 and TNF-α of mice in each group（±s）ng/mL

表4 各组小鼠IFN-γ、IL-23和TNF-α含量比较（±s）Tab.4 Comparison of the content of IFN-γ，IL-23 and TNF-α of mice in each group（±s）ng/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数 IFN-γ IL-23 TNF-α正常组 10 89.27± 9.54 36.11±5.38 12.27±3.80模型组 10 378.64±15.83* 174.57±8.36* 87.36±5.74*低剂量组 10 315.33±13.62*# 143.02±9.45*# 62.58±6.00*#高剂量组 10 256.70±14.46*#△ 99.47±8.28*#△ 43.42±5.83*#△甲氨蝶呤组 10 138.94±11.22*#△▲ 60.23±7.05*#△▲ 22.47±3.55*#△▲

2.4 各组小鼠HE染色结果 正常组小鼠表皮层薄，仅有少量炎性细胞；模型组小鼠表皮增厚，伴有角化过度或角化不全，真皮乳头出现水肿，伴血管扩张，棘层增厚，可见大量炎性细胞浸润；低剂量组小鼠皮肤病理损伤改善状况不明显，高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠角化不全细胞减少，炎性细胞浸润减少，病理损伤明显减轻。见图1。

图1 皮损组织HE染色（×400）Fig 1 HE staining of skin esion tissues(×400)

2.5 各组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量检测结果比较 各组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组AQP3和Cer mRNA相对表达量降低（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组和甲氨蝶呤组AQP3和CermRNA相对表达量升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和甲氨蝶呤组AQP3和Cer mRNA相对表达量升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，甲氨蝶呤组AQP3和Cer mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量比较（±s）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of AQP3 and Cer mRNA of mice in each group（±s）

表5 各组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量比较（±s）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of AQP3 and Cer mRNA of mice in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数 AQP3 Cer正常组 10 0.87±0.12 0.79±0.14模型组 10 0.26±0.09* 0.18±0.08*低剂量组 10 0.45±0.10*# 0.33±0.10*#高剂量组 10 0.57±0.11*#△ 0.50±0.10*#△甲氨蝶呤组 10 0.74±0.10*#△▲ 0.66±0.12*#△▲

2.6 各组小鼠蛋白印迹法检测结果比较 各组小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，模型组IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，低、高剂量组和甲氨蝶呤组IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组和甲氨蝶呤组IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与高剂量组比较，甲氨蝶呤组IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表6，图2。

表6 各组小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of the relative expression levels of IL-17，Notch，Jagged1 and Hes-1 protein of mice in each group（±s）

表6 各组小鼠IL-17、Notch、Jagged1和Hes-1蛋白相对表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of the relative expression levels of IL-17，Notch，Jagged1 and Hes-1 protein of mice in each group（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与低剂量组比较，△P＜0.05；与高剂量组比较，▲P＜0.05。

组别 动物数 IL-17 Notch-1 Jagged1 Hes-1正常组 10 0.14±0.04 0.13±0.04 0.11±0.05 0.14±0.05模型组 10 1.03±0.06* 1.01±0.06* 1.01±0.05* 0.98±0.07*低剂量组 10 0.88±0.05*# 0.89±0.06*# 0.74±0.04*# 0.67±0.06*#高剂量组 10 0.60±0.04*#△ 0.57±0.05*#△ 0.53±0.03*#△ 0.41±0.04*#△甲氨蝶呤组 10 0.32±0.04*#△▲ 0.33±0.04*#△▲ 0.22±0.04*#△▲ 0.20±0.04*#△▲

图2 各组小鼠皮肤组织中蛋白表达情况Fig.2 Expression level of proteins in skin tissue of mice in each group

3 讨论

银屑病是一种常见病和多发病，多累及皮肤和关节，具有顽固性及复发性的特点，因此给临床治疗带来了巨大困难。中医认为，银屑病是以血热证、血燥症以及血瘀证为基本证型，“辨血为主，从血论治”是其主要辨证论治规律。土茯苓是百合科植物光叶菝葜的干燥根茎，是一种常用中药，具有清热除湿解毒等功效。西医研究认为银屑病与遗传、免疫以及感染等因素有关，但其具体机制尚不明确。土茯苓总黄酮具有广泛的抗炎作用，Zhao等[10]研究表明，土茯苓总黄酮可抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应，降低多种炎症因子的分泌。Wang等[11]研究表明土茯苓总黄酮通过促进尿酸排泄，改善尿酸肾病大鼠肾脏氧化应激和炎症反应。丁瑞等[12]研究发现土茯苓通过调节尿酸转运体水平，同时抑制炎症因子产生，从而改善高尿酸血症小鼠的肾功能。Zhang等[13]研究表明，土茯苓总黄酮通过调节凋亡相关蛋白及阻滞细胞周期，从而抑制角质细胞增殖和分化，可能成为治疗银屑病的潜在药物。甲氨蝶呤是一种免疫抑制剂，对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用，而且具有较强的抗炎作用，但由于其治疗剂量接近于中毒剂量，因此用药安全方面存在一定风险，肝肾功能障碍、妊娠或哺乳期女性、贫血以及免疫缺陷等严重疾病时，不宜使用。而中药具有来源广、毒副作用小以及成本低等优点，因此中药的治疗作用受到广泛关注。本研究通过背部涂抹咪喹莫特软膏建立银屑病小鼠模型，探讨土茯苓总黄酮对银屑病小鼠炎症反应及皮肤瘙痒的改善作用。

皮肤瘙痒是银屑病患者常见的病症，虽然其不对患者生命安全造成威胁，但是会严重影响患者的精神状态和情绪，而且反复抓挠会造成更多炎症介质释放，从而产生更强烈的瘙痒，形成瘙痒-抓挠恶性循环，给患者的生活带来不悦[14]。

本实验中通过评估银屑病小鼠1 h内的抓挠次数判断小鼠的瘙痒程度，结果显示：模型组小鼠抓挠次数明显多于正常组，低、高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠抓挠次数明显少于模型组。AQP3是一种位于细胞膜上的水通道相关蛋白，是人皮肤细胞膜上表达最多的水通道蛋白，通过跨膜转运水分、甘油和尿素等调节皮肤细胞内外水平衡，可维持正常皮肤的屏障功能[15]。Cer是皮肤角质层细胞之间存在的混合脂类的主要成分，对外界刺激具有防护作用，还可防止水分散发，因此能滋润皮肤、抗过敏，同时，还可融合角质层蛋白形成皮肤屏障功能[16]。研究发现，银屑病小鼠皮损组织中AQP3和Cer表达降低，经治疗后两者表达升高，可改善皮肤损伤[17]。

本研究中模型组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量低于正常组，低、高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠AQP3和Cer mRNA相对表达量高于模型组，且具有剂量依赖性。说明：土茯苓总黄酮可降低瘙痒相关分子表达，减轻瘙痒程度。本研究通过对银屑病小鼠皮损部位进行病理评分，结果显示：模型组小鼠PASI评分高于正常组，低、高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠PASI评分低于模型组，且具有剂量依赖性。

同时，皮损部位HE染色结果显示：正常组小鼠表皮层菲薄，仅有少量炎性细胞；模型组小鼠表皮增厚，伴有角化过度或角化不全，真皮乳头出现水肿，伴血管扩张，棘层增厚，可见大量炎性细胞浸润；低剂量组小鼠皮肤病理损伤改善状况不明显，高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠角化不全细胞减少，炎性细胞浸润减少，病理损伤明显减轻。结果表明：土茯苓总黄酮可改善银屑病小鼠病理损伤。研究表明，免疫失调导致的炎症反应与银屑病密切相关，IFN-γ由Th1细胞产生，在银屑病中可促进角质细胞异常增生，促进皮肤炎症反应[18]。TNF-α是一种多功能性的细胞因子，在组织炎症、免疫调节中发挥重要作用，研究发现，TNF-α在人角质形成细胞中高表达[19]。IL-23由抗原递呈细胞分泌，与受体结合后，可诱导Th17细胞增殖，并产生包括IL-17、IL-22等多种细胞因子，这些细胞因子通过募集中性粒细胞，从而造成炎性损伤，包括银屑病。本研究中ELISA法检测IL-23、TNF-α和IFN-γ含量，结果显示：模型组小鼠血清中IL-23、TNF-α和IFN-γ含量高于正常组，低、高剂量组和甲氨蝶呤组小鼠血清中IL-23、TNF-α和IFN-γ含量低于模型组。结果表明：土茯苓总黄酮可减轻银屑病小鼠炎症反应。

银屑病是一种由T细胞介导的免疫性皮肤病，多种 T 细胞（Th1、Treg、Th2 以及 Th17）产生的细胞因子在银屑病中发挥作用，IL-17大多由Th17细胞分泌，可募集和活化中性粒细胞，诱导活化T细胞，还可刺激成纤维细胞、巨噬细胞等分泌细胞因子，从而促进多种炎性介质产生，诱导炎症反应[20]。Notch家族有Notch1-4 4个受体蛋白，目前，Notch-1是研究最为广泛的受体，Notch-1在T细胞的发展中起到重要作用，研究发现，Notch-1信号通过调节Th17/Treg免疫失衡从而参与银屑病[21]。Jagged-1是Notch受体的主要配体之一，Jagged-1通过与Notch配体细胞外结合区相结合，可诱导Notch信号转导，并通过下游信号因子Hes-1、NF-κB等转录调控因子调节靶基因转录。研究发现：在银屑病小鼠模型中，Notch-1、Jagged-1 和 Hes-1 高表达[22]。本研究蛋白印迹法检测小鼠皮损组织中各蛋白表达情况，结果显示：模型组IL-17、Notch-1、Jagged-1和Hes-1蛋白表达高于正常组，低、高剂量组和甲氨蝶呤组IL-17、Notch-1、Jagged-1和 Hes-1 蛋白表达低于模型组。结果表明：土茯苓总黄酮可抑制IL-17/Notch信号通路。

综上所述，土茯苓总黄酮可减轻银屑病小鼠皮肤瘙痒程度，改善病理损伤，减轻炎症反应，其可能是通过抑制IL-17/Notch信号通路发挥作用，为临床治疗银屑病提供理论依据。