食品加工机械材料橡胶密封垫圈中5种荧光增白剂迁移量的测定及其迁移规律研究

候德莉，徐 莉，梁振纲，戴小丽，吴毓浪

（海口海关技术中心，海南 海口 570311）

荧光增白剂（Fluorescent whitening agents，FWAs），亦称为白色染料，是一类能够吸收不可见紫外光，进而激发出可见蓝色或蓝紫色荧光的复杂有机化合物［1-3］。近年来，随着食品安全问题日渐突出，荧光增白剂的危害以及其向食品迁移的情况逐渐引起人们的重视。橡胶是制作密封垫圈最常见的材料之一，具有较好的综合机械性能、高度化学稳定和耐磨性等优势，在食品加工机械材料中应用广泛。但市场上不少商家在生产橡胶垫圈时使用劣质材料或回收材料以次充好，并通过非法添加荧光增白剂提高产品的艳度和白度，从而削减成本、增大利润。在食品加工过程中，受接触食品的种类、浓度、温度以及接触时间等因素的影响，橡胶垫圈中的荧光增白剂易渗透迁移到食品中，进而随食物进入人体，在体内与蛋白质结合后不易分解，可在肝脏和其他重要器官蓄积从而造成器官损坏甚至致癌［4-7］。因此，世界各国对食品接触材料中荧光增白剂的含量均有明确限制［8-11］，如我国国家标准GB 9685-2016规定FWA184和FWA393的特定迁移限量（SML）分别为0.6 mg/kg和0.05 mg/kg，欧盟法规2002/72/EC 规定FWA184 的SML 为0.6 mg/kg，美国联邦法规则规定FWA184 的加入量不得超过0.015%等，但都缺少配套的检测标准。

目前，荧光增白剂接触安全性的研究主要集中在纸张［12］、塑料制品［13-14］、化妆品［15-17］和纺织品［18］等基质，相关检测方法主要有紫外灯法［19］、分光光度法［20-21］、高效液相色谱法［22］、液相色谱-质谱联用法［23-24］等，其中液相色谱-串联质谱法结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱高选择性、高灵敏度的优点，在食品分析中应用广泛。但对食品加工机械材料橡胶密封垫圈中荧光增白剂的检测以及迁移规律的研究鲜有报道。因此，本文选取食品加工机械材料橡胶密封垫圈为基质，以FWA184、FWA185、FWA367、FWA135、FWA393为研究对象，建立了上述5种荧光增白剂的液相色谱-串联质谱检测方法，并在可预见的使用情形下选择最严苛的实验条件，探索5 种荧光增白剂向橄榄油模拟物的迁移规律。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC H-Class高效液相色谱仪（美国Waters公司）；API 4000 Q三重四极杆质谱仪（美国ABI公司），配有电喷雾离子源；Harvard II 针泵（美国Varian 公司）；DMV-16旋涡混匀器（广东科寅公司）；Centrifuge 5810 R 离心机（德国Eppendorf 公司）；SHZ-82 气浴恒温振荡器（常州澳华仪器公司）；电热恒温水浴锅（上海锦屏公司）；G-285电子天平（瑞士Mettler公司）。

FWA184 标准品（纯度≥99.9%，CAS：7128-64-5），FWA185 标准品（纯度≥99.6%，CAS：2866-43-5），FWA393 标准品（纯度≥96.6%，CAS：1533-45-5），FWA367 标准品（纯度≥98.3%，CAS：5089-22-5），FWA135标准品（纯度≥98.9%，CAS：1041-00-5）购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（色谱纯，美国Tedia 公司）；甲酸（色谱纯，德国Merck 公司）、冰乙酸（分析纯，美国Fisher Scientific 公司）、无水乙醇（优级纯，科密欧公司）；橄榄油（化学纯，麦克林公司）；三元乙丙橡胶（牌号EPDM 6470，德国Lanxess 化学公司产品）；超纯水由实验室超纯水机制备；C18、PLS、AL-N、PSA、PH、GCB净化剂（迪马科技公司）；微孔滤膜（0.22 μm，有机系）。

1.2 标准溶液配制

标准储备液（1 mg/mL）：各称取5种荧光增白剂标准品10 mg（精确至0.01 mg），分别用丙酮溶解并定容至10 mL，于4 ℃避光保存。

混合标准中间液（1 μg/mL）：分别吸取适量上述标准储备液，用丙酮定容至10 mL，得到混合标准中间液。

1.3 色谱条件

色谱柱：资生堂MGⅡC18（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱温：40 ℃。流动相：A 相为0.1%甲酸水溶液，B 相为乙腈，梯度洗脱程序：0～1.0 min，90%～60% A；1.0～3.0 min，60%～10% A；3.0～11.0 min，10%A；11.0～12.0 min，10%～90%A；12.0～14.0 min，90%A。流速：0.6 mL/min；进样体积：1 μL。

1.4 质谱条件

电喷雾正离子扫描（ESI+）；离子源电压5 500 V；离子源温度550 ℃；多反应监测（MRM）模式；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气。5 种荧光增白剂标准品溶液通过针泵流动注射直接进样，一级质谱全扫描确定化合物母离子，对母离子碰撞后进行二级质谱扫描，得到碎片离子。优化后的质谱条件见表1。

表1 MRM模式下5种荧光增白剂的质谱参数Table 1 Mass parameters of 5 fluorescent whitening agents under MRM mode

1.5 实验方法

1.5.1 样品制备取5 种待测组分各5 g 加至1 kg 三元乙丙橡胶中，经硫化后得到特制阳性样品（食品级）。

1.5.2 食品模拟物的选取依据GB 5009.156-2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》［25］和GB 31604.1-2015《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验通则》［26］要求，选取水、4%乙酸水溶液、50%乙醇水溶液、橄榄油4 种食品模拟物分别代表水基非酸性食品、水基酸性食品、酒精类食品和油基食品进行迁移试验。

1.5.3 提取水基性和酒精性食品模拟物经迁移试验处理后，准确称取5.0 g（精确至0.001 g）于10 mL比色管中，以流动相定容至刻度，混匀后取1 mL至进样瓶，待测；橄榄油食品模拟物基质复杂，对荧光增白剂附着度高，试验准确称取1.0 g（精确至0.001 g）橄榄油模拟物于玻璃离心管中，加入10 mL丙酮溶解，涡旋3 min，取1 mL样液，加入50 mg C18粉末净化，涡旋离心后，取上清液过微孔滤膜，进LC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

由于FWAs 极性小、易溶于油脂中与油深度结合，采用甲醇、甲醇水、乙腈等有机溶剂均无法将待测组分有效萃取；小极性溶剂如正己烷、乙酸乙酯与流动相不互溶，不适合作为提取溶剂。橄榄油和待测组分可有效溶解于丙酮、二氯甲烷中，本文尝试以两者为提取溶剂，直接将橄榄油样品溶解后萃取。结果表明，二氯甲烷作为提取溶剂时对FWA367、FWA393、FWA184无回收，丙酮对5种FWAs均有较好的提取效果，因此采用丙酮作为提取溶剂。

2.2 净化条件的选择

丙酮提取后的样液直接进LC-MS/MS检测，结果显示FWA185、FWA184、FWA135有极强的基质增强效应。考虑到丙酮作为溶剂不适合采用反相吸附的固相萃取小柱净化，本文通过分散固相萃取法，正相吸附提取溶剂中的基质干扰物，分别考察了PLS、Al-N、PH、C18、PSA、GCB 6种净化剂的净化效果。结果表明，PLS、PSA 和Al-N 对FWA367 有吸附作用，回收率低于60%；PH 无法清除FWA184的基质增强效应，回收率大于150%；使用GCB 净化时，FWA184 回收率低于80%，其余组分回收率均低于10%；而C18作为净化剂时，所有组分的回收率均在80%～110%范围，故采用C18作为净化剂。不同净化方式在0.05 mg/kg加标水平的回收率见图1。

图1 不同净化方式在0.05 mg/kg加标水平的回收率Fig.1 Recovery under different purification methods at 0.05 mg/kg spiked level

2.3 流动相选择

分别考察了乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol/L 乙酸铵溶液、乙腈-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸铵）溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-10 mmol/L 乙酸铵溶液、甲醇-0.1%甲酸（10 mmol/L 乙酸铵）溶液6 种流动相体系对峰形和响应值的影响。结果表明，乙酸铵作为流动相会抑制FWA393 的响应，而甲酸的加入能够促进化合物离子化，使响应值增高；乙腈-0.1%甲酸溶液体系相对甲醇-0.1%甲酸溶液体系洗脱效果好，且体系压力低，能够有效保护仪器和延长色谱柱使用寿命，故采用乙腈-0.1%甲酸溶液体系作为流动相。

2.4 基质效应、线性关系及定量下限

基质效应对检测结果的准确度和精密度存在重要影响［27］，本文采用相对响应值法（基质中待测组分响应/纯溶剂中待测组分响应× 100%）［28］考察5 种FWAs 在橄榄油食品模拟物中的基质效应。将3组阴性橄榄油基质在优化条件下进行提取和净化，用净化后的基质样液配制50 ng/mL 的5 种FWAs 混合标准品，分别以3 组响应值结果的平均值与纯溶剂配制的50 ng/mL 的5 种FWAs混合标准品的响应值进行比较评价基质效应。结果表明，经C18净化后，5种FWAs在橄榄油食品模拟物中的相对响应值均在80%～100%范围内，属于弱基质效应，可直接采用溶剂配制标准曲线进行定量。

将混合标准溶液配制成5、10、20、50、80、100 ng/mL 的系列标准溶液，在优化条件下依次进样分析，以目标化合物的质量浓度（x）为横坐标，定量离子的峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，5种FWAs在5～100 ng/mL范围内有良好的线性关系，相关系数r≥0.999 1。根据10倍信噪比并计入试样量和定容体积，计算定量下限（LOQ）。得到5种FWAs在水模拟物中的定量下限为0.001～0.003 mg/kg，在3%乙酸模拟物中的定量下限为0.002～0.003 mg/kg，在50%乙醇中的定量下限为0.001～0.005 mg/kg，在橄榄油模拟物中的定量下限为0.008～0.050 mg/kg。

2.5 回收率与相对标准偏差

以空白橄榄油食品模拟物为基质，对其进行3个水平（0.05、0.1、0.5 mg/kg）10个平行的加标回收实验，考察方法的回收率和相对标准偏差（RSD）。方法的平均回收率为81.8%～101%，RSD 为1.2%～5.6%，结果见表2。

表2 橄榄油中5种荧光增白剂的平均回收率和相对标准偏差（n=10）Table 2 Recoveries and RSDs of 5 fluorescent whitening agents in olive oil（n=10）

2.6 实际样品检测

应用本方法对市售4 种材质（丁腈橡胶、硅橡胶、三元乙丙橡胶、氟橡胶）橡胶密封垫圈样品进行测定，所选样品均标注食品级。以橄榄油模拟物为浸泡液，70 ℃条件下浸泡24 h，所得食品模拟物按照“1.5.3”方法处理后采用高效液相色谱-串联质谱法分析。结果在丁腈橡胶材质样品的橄榄油模拟物中检出FWA184，迁移量为26.6 μg/L，换算为特定迁移量为0.19 mg/kg，未超过GB 9685-2016［8］规定的FWA184 特定迁移限量（SML）（0.6 mg/kg）的要求。其余3 种材质样品的橄榄油模拟物中均未检出5种荧光增白剂。

3 迁移规律研究

3.1 食品模拟物对迁移量的影响

按照GB 31604.1-2015 《食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则》［26］和GB 5009.156-2016《食品安全国家标准食品接触材料及制品迁移试验预处理方法通则》［25］要求，测定了特制阳性样品中5种荧光增白剂在超纯水、4%乙酸溶液、50%乙醇溶液和橄榄油模拟物中于70 ℃条件下浸泡30 h的迁移情况，每种模拟物平行测定6次，取其平均值，结果见表3。

表3 不同模拟物中荧光增白剂迁移量检测结果Table 3 Migration of 5 fluorescent whitening agents into 4 kinds of stimulants

结果表明，5 种荧光增白剂在超纯水和4%乙酸水溶液中未发生迁移；在50%乙醇水溶液中仅FWA367、FWA185 和FWA184 有 少 量 迁 移，迁 移 量 分 别 为5.22、1.04、7.21 mg/L，FWA393、FWA135未检出；在橄榄油模拟物中，5种荧光增白剂均有不同程度迁移，迁移量远大于其他模拟迁移物，其中，FWA184和FWA185的迁移量接近阳性样品制备时的添加量。原因可能与5种荧光增白剂的脂溶属性有关：本研究选取的5 种荧光增白剂均为含有苯并唑共轭体系的脂溶性化合物，更易溶于橄榄油。因此，后续影响因素的考察使用橄榄油作为食品模拟物。

3.2 温度对迁移量的影响

选用橄榄油作为食品模拟物，浸泡时间为2 h，考察了橡胶密封垫圈中5 种荧光增白剂在5、20、40、70、100 ℃条件下的迁移量变化情况。结果见图2。

由图2可以看出，橡胶密封垫圈中5种荧光增白剂的迁移量随温度的升高而增加。在5～40 ℃条件下，迁移量处在较低浓度水平，增长趋势接近且变化较小；当温度高于40 ℃后，除FWA135 外，其余4 种荧光增白剂的迁移量明显增加，且随着温度升高迁移量增幅变大；在100 ℃条件下，5 种荧光增白剂均快速迁出，其中FWA184 迁移量接近阳性样品的制备添加量。这可能是由于温度升高，材料内部分子活化能增大，高分子链段构象改变形成内部空间，促使小分子发生跃迁，加快了物质从材料向模拟物的迁移。

图2 温度对5种荧光增白剂迁移量的影响Fig.2 Effect of contact temperature on migration of 5 fluorescent whitening agents

3.3 时间对迁移量的影响

在40 ℃和70 ℃温度条件下，考察了密封橡胶垫圈中5种荧光增白剂在橄榄油模拟物中的迁移量随时间的变化情况，结果见图3。由图3 可以看出，在两种迁移温度下，5 种荧光增白剂的迁移量在前10 h 均快速增大，随后迁移速率减缓直至趋于平衡，其中FWA135 和FWA393 始终处于低迁移状态。与40 ℃相比，70 ℃下的迁移量和迁移速率增大，除FWA135 和FWA393 外，其余3 种荧光增白剂的时间释放曲线类似。70 ℃条件下，5 种荧光增白剂达到最大迁移量的时间为24 h，40 ℃条件下达到最大迁移量时间为120 h。这可能是因为温度升高，加剧了材料中的分子运动，使成品表层残留的荧光增白剂更容易迁移释放，表现为快速迁移释放过程；而在40 ℃条件下，荧光增白剂需要充分浸泡才能通过橡胶密封垫圈材料的致密结构，表现为缓慢迁移释放过程。

图3 40 ℃（A）和70 ℃（B）条件下时间对荧光增白剂迁移量的影响Fig.3 Effect of time on migration of 5 fluorescent whitening agents at 40 ℃（A）and 70 ℃（B）

4 结 论

本文建立了食品加工机械材料橡胶密封垫圈中5 种FWAs 迁移量的LC-MS/MS 检测方法。采用丙酮萃取，C18吸附净化。结果表明，该方法快速准确、选择性好、灵敏度高、重复性好，回收率、精确度和准确度均能够满足食品加工机械材料橡胶密封垫圈中5 种荧光增白剂特定迁移量的测定要求。同时，研究了模拟物、迁移温度、迁移时间对迁移规律的影响。结果表明，5种FWAs在油基类食品模拟物中迁移能力最强，迁移量随迁移温度的升高不断增加，随迁移时间的延长呈现先快速增长随后趋于平衡的规律。由此可见，在食品机械化加工过程中，含橡胶密封垫圈接口的管路对盛装含油脂类的食品存在一定风险，生产企业在食品生产加工过程中应根据实际情况选择合适的机械材料，保证消费者身体健康。