羟基多壁碳纳米管分散固相萃取/气相色谱-串联质谱法测定党参中75种农药残留

杨志敏，常巧英，李 坚，许晓辉，薛华丽，朱仁愿

（1.兰州市食品药品检验检测研究院，食品中农药兽药残留监控重点实验室，甘肃 兰州 730050；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3.甘肃农业大学 理学院，甘肃 兰州 730070；4.天津科技大学省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457）

党参（Codonopsis radix）属桔梗科植物，是多年生草本植物党参属的根，为药食两用的道地药材，具有补中益气、生津止渴、健脾益肺之功效［1］。党参在种植、加工及储存过程中，需用化学农药抑制或防止病虫害，以保障其产量和质量，但农药的不规范使用不可避免地会导致残留的发生。近年来，农药残留问题已成为社会各方面关注的焦点。《中国药典》对中药材中农药残留限量做出规定的农药数量只涉及33 种，GB 2763-2021 《食品中农药最大残留限量》［2］也未针对党参中农药残留做出限量规定，只有较少农药在药用植物中有限量规定。因此，建立党参中农药多残留的分析方法具有重要意义。

目前，中药材中农药残留的检测方法主要有气相色谱法［3-6］、液相色谱法［7］、气相色谱-串联质谱法［8-12］、液相色谱-串联质谱法［13-17］、飞行时间质谱法［18-20］、拉曼光谱法［21］等，与之相关的前处理方法有固相萃取法、固相微萃取法、液液微萃取法、分散固相萃取法等［3-21］。其中，分散固相萃取法因操作简单、价格低廉等优点被广泛应用于食品、环境、中药材等领域。该方法利用净化剂吸附基质中的杂质达到净化目的。目前常用的净化剂有N-丙基乙二胺（PSA）硅烷化硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化碳（GCB）吸附剂，主要用于含水量高、基质简单的样品，对于复杂基质的样品有待探索使用新型吸附剂。碳纳米管（CNTs）是碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳米级中空管［22］，因化学性质稳定、比表面积大、吸附力强、易于改性和修饰等特点，近年来在农药多残留的前处理检测技术中显示了优异的特性［23-24］。

党参中含有大量的色素、党参苷、脂类、多糖、生物碱等成分［25］，而农药残留含量往往很低，有效去除杂质干扰是实现痕量分析准确性的关键因素。目前关于党参中农药残留的测定方法主要有气相色谱法［5-6］、气相色谱-串联质谱法［10］、液相色谱-串联质谱法［15-17］、飞行时间质谱法［20］等，其中质谱技术在农药多残留检测中优势突出。党参中农药残留前处理方法鲜见利用碳纳米管作为吸附材料的报道。本文以羟基多壁碳纳米管（MWCNTs-OH）为净化吸附剂，通过优化提取溶剂、提取体系、净化填料组合改进前处理方法，结合气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）技术建立了党参中农药多残留的测定方法，为中药材中农药多残留的检测提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7000D 气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent 公司）；5810R 高速低温离心机（德国Eppendor公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；VORTEX-2涡旋振荡器、KS40001控制型控温摇床、A11 基本型分析研磨机（德国IKA 公司）；AUTO-EVA-60 全自动平行浓缩仪（睿科集团股份有限公司）。

无水硫酸镁、氯化钠、乙酸钠、柠檬酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；PSA、C18、GCB（美国Agilent 公司）；多壁碳纳米管（MWCNTs）和羟基多壁碳纳米管（MWCNTs-OH）（中国科学院成都有机化学有限公司）。75种农药标准品（纯度均≥95.0%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。正己烷、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，德国Merck公司）；丙酮（色谱纯，科密欧化学试剂有限公司）；冰乙酸（西陇化工股份有限公司）。

1.2 标准溶液的配制

称取10 mg（精确至0.01 mg）标准品分别置于10 mL 容量瓶中，用丙酮稀释定容至刻度，于-18 ℃低温避光保存。准确移取一定体积的标准储备液，用乙酸乙酯稀释为0.4 mg/L 的混合标准工作液，于-18 ℃避光保存。

称取党参空白样品，按照“1.3”样品处理方法进行提取、净化、离心、浓缩、复溶和过膜后制备空白样品提取液，临用前吸取适量标准工作液，配制成质量浓度分别为5、10、25、50、100、200、300 μg/L的系列基质混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

将党参的干燥根置于高速粉碎机中粉碎至粉末状，过100 目筛，混匀，备用。准确称取2 g 样品（精确至1 mg）至50 mL 离心管中，加入5.0 mL 超纯水，涡旋，充分浸润样品，放置30 min。再加入10.0 mL 乙酸乙酯和一颗陶瓷均质子，涡旋混匀，300 r/min 振摇10 min，加入6.0 g无水硫酸镁、1.5 g乙酸钠，立即摇散混匀，300 r/min 振摇10 min，以4 ℃、3 900 r/min 离心5 min。取3.0 mL 上清液，置于预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（无水MgSO4450 mg、PSA 100 mg、MWCNTs-OH 3 mg）中，涡旋使充分混匀，1 000 r/min 振荡10 min 使净化完全，4 ℃、3 900 r/min 离心5 min，取2.0 mL 净化液氮吹至近干，用1.0 mL乙酸乙酯复溶，过膜，待测。

1.4 色谱与质谱条件

HP-5MS UI毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升温至170 ℃，再以10 ℃/min升温至310 ℃并保持3 min；载气为氦气（纯度99.999%）；进样量1.0 μL；不分流进样；进样口温度：280 ℃；传输线温度：280 ℃；流速：0.9 mL/min。离子源：EI源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；动态多反应监测（dMRM）扫描模式；溶剂延迟：2.5 min。75种农药的质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

对75 种农药的混合标准溶液在m/z50～500 范围内进行全扫描，使用NIST 标准库匹配检索，确定目标物的保留时间，并对其前级离子、产物离子及碰撞能量等质谱参数进行优化，利用软件自带的dMRM 模式进一步优化。该检测方法可简化分析流程，提高分析效率，适合农药多残留的分析。图1为优化条件下75种农药（0.1 mg/L）的总离子流图。

图1 75种农药（0.1 mg/L）在MRM模式下的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 75 pesticides in MRM mode（0.1 mg/L）

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂的选择由于目标农药种类多、极性差异大，因此筛选适合大多数农药的提取溶剂尤为重要。本实验分别对比了丙酮、乙酸乙酯、正己烷-丙酮（1∶1）、乙腈、1%乙酸乙腈作为溶剂提取75 种农药的回收率（图2）。结果表明，回收率在70%～120%范围内目标农药数量最多的提取溶剂为乙酸乙酯（72种农药），其次为乙腈（67种农药）。乙酰甲胺磷、乐果、硫环磷、甲基硫环磷和唑螨酯在乙酸乙酯中的回收率均在70%～120%范围，而在乙腈中的回收率低于70%或高于120%，尤其上述4种有机磷农药在乙酸乙酯中的回收率显著高于乙腈，这5种农药的极性均较强，回收率偏低可能与极性有关。因此，实验选择乙酸乙酯为提取溶剂。

图2 提取溶剂对提取效果的影响Fig.2 Effects of different solvent on the extraction efficiency

2.2.2 提取体系的优化本实验涉及有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类等多种农药，为防止提取过程中由于酸碱不稳定导致农药分解，需形成缓冲盐体系以减少农药的损失。考察了3 种提取体系（体系1：无水MgSO46.0 g + NaCl 1.5 g；体系2：无水MgSO46.0 g + NaAc 1.5 g；体系3：无水MgSO45.0g + NaCl 1.0 g + Na3C6H5O71.5 g）对75 种目标农药提取效果的影响（图3）。结果表明，第2 种提取体系的整体回收率最佳，且回收率在70%～120%范围内的农药数量最多，回收率低于70%或高于120%的农药较其它两种提取体系少。因此，实验以无水MgSO46.0 g + NaAc 1.5 g 为最佳提取体系。

图3 不同提取体系对提取效果的影响Fig.3 Effects of different solution system on the extraction efficiency

2.2.3 吸附剂种类的考察固定无水MgSO4450 mg 和PSA 100 mg，考察了不添加其它吸附剂和分别添加30 mg C18、GCB、MWCNTs、MWCNTs-OH 吸附剂5 种方案的净化效果，发现添加GCB 和MWCNTs-OH 两种方案的回收率在70%～120%范围内的农药数量最多，考虑到实验成本，选择无水MgSO4、PSA和MWCNTs-OH为净化吸附剂。

2.2.4 MWCNTs-OH 用量的选择固定无水MgSO4为450 mg，PSA 为100 mg，将3 mL 提取液分别加入净化管中，考察了MWCNTs-OH 不同用量（0、3、5、10、20、30、40 mg）对农药回收率的影响（见图4）。结果发现，MWCNTs-OH 用量为3 mg时，回收率在70%～120%的农药数量最多。因此，本实验以MgSO4450 mg+PSA 100 mg+MWCNTs-OH 3 mg为最佳净化剂组合。

图4 MWCNTs-OH用量对净化效果的影响Fig.4 Effects of amount of MWCNTs-OH on the purification efficiency

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、检出限及定量下限采用本方法对质量浓度分别为5、10、25、50、100、200、300 μg/L 的系列基质混合标准工作溶液进行测定，以各农药的质量浓度为横坐标（x，mg/L），对应的峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。结果表明，75 种农药在5～300 μg/L 质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r2）均不低于0.996 1。以阴性样品加标处理后采用本方法进行检测，得到检出限（S/N= 3）为0.001～0.054 mg/kg，定量下限（S/N= 10）为0.002～0.178 mg/kg（见表1），符合多数农药残留的筛查要求。

2.3.2 准确度与精密度向阴性样品中分别添加0.025、0.05、0.20、0.50 mg/kg 4 个水平的混合标准溶液，每个水平重复4 次，采用本方法测定并计算各农药的平均加标回收率。75 种农药在党参中的平均回收率为69.7%～113%，相对标准偏差（RSD，n=4）为0.64%～6.7%（见表1），方法的准确度和精密度满足农药多残留分析的要求。

表1 75种农药的保留时间、MRM参数、相关系数、检出限、定量下限、平均加标回收率及相对标准偏差（n=4）Table 1 Retention times，MRM parameters，correlation coefficients，LODs，LOQs，average recoveries and RSDs（n=4）of 75 pesticides

（续表1）

（续表1）

（续表1）

2.4 基质效应的考察

基质效应（ME）是基质匹配标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率之差，除以溶剂标准曲线斜率的比值。当ME 为正值时，呈现基质增强效应；反之则呈基质减弱效应。当ME 小于20%时，基质效应较弱，可忽略不计；ME 大于50%时，呈强基质效应；ME 在20%～50%范围，则为中等基质效应。考察了75种农药在党参中的基质效应（图5），结果表明，93%的农药为基质增强效应，7%的农药为基质减弱效应。其中57%的农药基质效应可忽略，19%的农药为中等基质效应，24%的农药为强基质效应。为弥补基质效应产生的差异，本实验采用基质匹配标准曲线法降低基质效应的影响。

图5 75种农药在党参中的基质效应Fig.5 Matrix effects of 75 pesticides in codonopsis radix

2.5 实际样品检测

采用本方法检测购自中药市场、药店的30批党参样品，结果显示，在7批样品中共检出6种农药，其中1 批样品检出甲拌磷（0.563 mg/kg），1 批样品检出二嗪磷（0.112 mg/kg）和氯唑磷（0.120 mg/kg），1批样品检出四氯硝基苯（0.013 mg/kg）和五氯硝基苯（0.312 mg/kg），2批样品检出甲基异柳磷（含量分别为0.014、0.018 mg/kg），2 批样品检出氯唑磷（含量分别为0.511、1.68 mg/kg）；其余样品均未检出。《中国药典》2020年版规定了33种农药的最大残留限量，其中甲拌磷、氯唑磷和甲基异柳磷的限量分别不得超过0.02 mg/kg、0.01 mg/kg和0.02 mg/kg，本文检出的甲拌磷、氯唑磷均超标；甲基异柳磷未超标；《中国药典》未规定其它3种农药的残留限量，故参照GB 2763-2021标准，其中四氯硝基苯参照马铃薯的限量为20 mg/kg，五氯硝基苯参照根茎类调味料的限量为2 mg/kg，二嗪磷参照白术（鲜）的限量为0.3 mg/kg，上述3种农药的残留量均未超标；二嗪磷若参照白术（干）的限量0.1 mg/kg，超标。

3 结 论

本文针对党参中农药多残留检测的前处理条件进行了深入研究，利用新型净化剂羟基多壁碳纳米管优化净化填料组合，提高了净化效果。将改进的前处理方法与GC-MS/MS联用构建了党参中农药多残留的高通量检测方法。该方法操作简单、准确灵敏且经济适用，为党参中农药多残留的快速筛查检测提供了可靠的分析手段。