超高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定蜂蜜中12种糖组分

贾 茹，黄学者，贾光群，石玉秋，崔宗岩*，郭泽镔*

（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；2.秦皇岛海关技术中心，河北 秦皇岛 066004）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜味物质［1］。蜂蜜中含有丰富的营养物质，包括糖类、维生素、矿物质和蛋白质等［2］。其中，糖类物质占蜂蜜总含量的65%～75%，除了果糖、葡萄糖这两种主要单糖类物质外，蜂蜜中还含有微量的蔗糖、松二糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖等二糖或三糖物质［3］。

我国食品安全国家标准GB 5009.8-2016［4］中规定了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定方法，但对于我国蜂蜜中其它种类的二糖和三糖（松二糖、麦芽酮糖、曲二糖、异麦芽蔗糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖等）缺乏相应的检测方法。对于当前市场上存在的部分掺假蜂蜜，仅基于单糖组分（果糖和葡萄糖），难以区分蜂蜜和糖浆，因而蜂蜜中微量二糖和三糖组分的检测显得尤为重要。

目前，蜂蜜中糖类化合物的检测方法包括高效液相色谱-示差折光检测法（HPLC-RID）［5-7］、高效液相色谱-蒸发光检测法（HPLC-ELSD）［8-9］、高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAECPAD）［10］、近红外光谱法（NIR）［11］、气相色谱-质谱法（GC-MS）［12-13］、液相色谱-质谱法［14］、核磁共振波谱法（NMR）［15-16］和滴定法［17］等。其中最为常用的是HPLC-RID法，该方法可用于蜂蜜中果糖和葡萄糖的准确定量，但松二糖、麦芽酮糖、吡喃葡糖基蔗糖和松三糖等微量糖组分在蜂蜜中的含量远低于果糖和葡萄糖，RID的灵敏度无法满足其检测要求，且不能进行梯度洗脱，导致分离效果相对较差，分析时间较长；ELSD灵敏度比RID高，可利用梯度洗脱对蜂蜜中的二糖和三糖进行有效分离，且已有大量研究表明HPLC-ELSD 可用于蜂蜜中微量糖分的准确定量［18-21］。基于此，本研究建立了采用UPLC-ELSD 测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、麦芽糖、曲二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖的方法，以期可同时准确定量蜂蜜中12种糖组分，从而为蜂蜜品质和质量评价提供支撑。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、枣花蜜、洋槐蜜、荔枝蜜和百花蜜等样品均于2020～2021年间采集自我国河北、陕西、山西、四川、辽宁、黑龙江等地蜂场。

乙腈（色谱纯）和三乙胺（优级纯）购自迪马公司，实验用水为GB/T 6682规定的一级水。

果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、麦芽糖、曲二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖标准物质的纯度均≥98%，购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪 器

Acquity UHPLC I-Class 超高效液相色谱仪配蒸发光散射检测器、Waters 2695 高效液相色谱仪配示差检测器（美国Waters公司）；分析天平（感量0.1 mg，0.001 g，梅特勒-托利多仪器有限公司）；微量可调移液器（100、1 000 μL，德国Eppendorf 公司）；Milli-Q IQ 7000 型超纯水发生器（美国Merck Millipore公司）。

1.3 标准溶液的配制

标准储备溶液：分别称取果糖和葡萄糖标准物质各4.0 g（精确至1 mg），置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL 水溶解，用乙腈定容，摇匀，配制成各标准物质储备液，质量浓度为40 g/L；分别称取蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、麦芽糖、曲二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖标准物质各0.2 g（精确至1 mg），置于10 mL容量瓶中，加入6 mL水溶解，用乙腈定容，摇匀，配制成各标准物质储备液，各糖组分储备液质量浓度均为20 g/L。上述储备液均于4 ℃冰箱储存。

标准工作溶液：分别吸取果糖和葡萄糖标准储备溶液各2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（40∶60）稀释并定容，混匀，分别配制成8、12、16、20、24 g/L的果糖和葡萄糖标准工作溶液；分别吸取蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、麦芽糖、曲二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖标准储备溶液0.05、0.1、0.25、0.5、0.75 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈-水（40∶60）稀释并定容，混匀，分别配制成0.1、0.2、0.5、1、1.5 g/L 的10 种糖混合标准工作溶液，用于绘制标准工作曲线。该工作溶液现用现配。

果糖和葡萄糖模拟样品配制：分别称取40 g 果糖和32 g 葡萄糖于100 mL 烧杯中，加入28 mL 去离子水，搅拌溶解并混合均匀。

1.4 样品预处理

称取2.5 g（精确至0.001 g）蜂蜜样品，置于50 mL烧杯中，加入15 mL水，用玻璃棒搅拌使试样完全溶解，转移至50 mL 容量瓶中，用5 mL 水清洗烧杯并转移至上述50 mL 容量瓶中，重复3 次，用乙腈定容，混合均匀后过0.22 μm滤膜，置于样品瓶中供液相色谱测定。

1.5 高效液相色谱条件

1.5.1 UPLC-ELSD 色谱条件色谱柱：Amide（1.7 μm，150 mm×2.1 mm i.d）（或相似规格）；柱温：60 ℃；进样量：3 μL。流动相A：乙腈（含0.1%三乙胺）；流动相B：水；流速：0.25 mL/min。梯度洗脱条件：0～3 min，10% B；3～10 min，10%～20% B；10～23 min，20% B；23～26 min，20%～35%B；26～28 min，35%B；28～29 min，35%～10%B；29～35 min，10%B。

蜂蜜中的果糖和葡萄糖含量远高于其余10种糖组分，检测条件如下：

果糖和葡萄糖测定条件：喷雾器模式：冷却；增益值：1；漂移管温度：55 ℃；气体压力：207 kPa（30 psi）。

蔗糖等10种糖测定条件：喷雾器模式：加热，动力水平：60%；增益值：5；漂移管温度：55 ℃；气体压力：207 kPa（30 psi）。

1.5.2 HPLC-RID 色谱条件色谱柱：Amide（3.5 μm，250 mm×4.6 mm i.d）（或相似规格）；进样量：10 μL。流动相：乙腈（含0.1%三乙胺）-水（75∶25）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

实验对样品前处理的稀释倍数进行了优化。蜂蜜成分以糖类为主，极易溶于水，可直接用去离子水稀释后进样检测。不同的稀释倍数会对仪器和结果造成不同的影响：稀释倍数过低易对仪器造成污染，同时，会缩短色谱柱的使用寿命；稀释倍数过高则会导致方法的重复性和灵敏度变差。经多次试验，最终选择稀释倍数为1∶20，在该条件下，实验方法的灵敏度和重复性良好，同时也不会对仪器造成严重污染。

2.2 UPLC-ELSD条件优化

2.2.1 色谱柱的选择目前，糖类检测常用的色谱柱有NH2型和离子交换型。离子交换柱按照分子量的大小对糖类化合物进行分离，而蜂蜜中多种二糖、三糖分子量相同，在离子交换柱上难以实现有效分离。实验结果表明，在优化的梯度洗脱条件下，使用NH2柱可实现10种糖组分良好的分离且峰形较好，因此选择NH2型色谱柱。

2.2.2 ELSD 条件的优化针对10 种微量糖分，选择1 g/L 的10 种糖混合标准溶液对ELSD 的增益系数、漂移管温度、喷雾器气体压力及模式等参数进行选择和优化。结果发现，在增益系数为5，漂移管温度为55 ℃，喷雾气压力为207 kPa（30 psi），加热模式下，可获得高的灵敏度和响应值。

2.3 线性关系与检出限

将配制好的果糖和葡萄糖混合标准溶液和10种糖混合标准溶液分别按照上述色谱条件测定，以峰面积的对数值（y）为纵坐标，标准工作液浓度的对数值（x）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，12 种糖的线性关系良好，相关系数（r2）为0.997 7～0.999 8。以3 倍信噪比（S/N）对应的浓度为方法检出限（LOD），10 倍信噪比对应的浓度为方法定量下限（LOQ）。结果表明该方法对蜂蜜中果糖和葡萄糖的LOD 为0.5 g/100 g，LOQ 为1.0 g/100 g，其余10 种糖组分的LOD 均为0.1 g/100 g，定量下限均为0.2 g/100 g，满足蜂蜜中12 种糖组分的检测要求。12 种糖组分标准溶液和代表性样品（荆条蜜）的色谱图见图1。

图1 12种糖组分标准溶液及代表性样品的UPLC-ELSD色谱图Fig.1 UPLC-ELSD chromatograms of 12 saccharides standard solutions and representative samples

2.4 准确度与精密度

2.4.1 果糖及葡萄糖由于蜂蜜中的果糖和葡萄糖是主要物质，含量一般在60 g/100 g以上，无法进行加标回收实验。本文通过与HPLC-RID法比对的方式，验证方法准确性。选取代表性样品洋槐蜜、荆条蜜、油菜蜜、枣花蜜和椴树蜜，按“1.5”实验条件，分别进行HPLC-ELSD和HPLC-RID测定，每个样品平行测定3次。结果表明，两种方法测定均值的相对偏差均在4.3%以内。在显著水平α=5%的情况下进行F检验，结果表明两种方法的结果无显著性差异（P＞0.05），说明本方法结果准确可靠。

2.4.2 其余10 种糖除果糖和葡萄糖之外，蜂蜜含有的松二糖、蔗糖、麦芽糖等糖组分的含量远高于本方法的定量下限，无法通过加标回收方式验证方法准确性。故采用果糖+ 葡萄糖+ 水（40∶32∶28，质量比）配制模拟样品代替蜂蜜样品进行低、中、高（0.2、0.4、2.0 g/100 g）水平的加标回收实验，每个水平平行测定6次，其回收率和相对标准偏差（RSD）见表1。结果表明，10种糖组分的平均加标回收率为97.0%～105%，RSD为0.70%～5.4%，说明此方法准确度和精密度良好。

表1 10种糖空白模拟样在低、中、高水平的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 1 Recoveries and RSDs（n=6）of 10 saccharides spiked at low，medium and high concentration levels in a blank substitute honey sample（n=6）

选取代表性洋槐蜜、荆条蜜、油菜蜜、荔枝蜜、椴树蜜和百花蜜样品，进行10种糖组分高浓度水平（1.0 g/100 g）的加标回收实验，其回收率和RSD 数据见表2。结果表明，10 种糖的平均回收率为90.0%～105%，RSD为1.0%～5.8%，满足方法学要求。

表2 荆条蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、百花蜜、油菜蜜和椴树蜜添加1.0%含量10种糖的回收率和相对标准偏差Table 2 Recoveries and RSDs of 10 saccharides at the spiked level of 1.0%in vitex honey，litchi honey，acacia honey，multifloral honey，rape honey and linden honey

（续表2）

2.5 实际样品检测

采用建立的方法对我国5 种主要大宗蜜源蜂蜜共72 个样品（15 个油菜蜜、14 个洋槐蜜、15 个荆条蜜、14个椴树蜜、14个枣花蜜）进行测定，通过对比分析，发现不同蜜种的蜂蜜中糖分存在明显差异。

如表3 所示，果糖和葡萄糖为蜂蜜的主要糖分，洋槐蜜中果糖含量最高，平均含量为（42.78±0.87）g/100 g；油菜蜜中果糖含量最低，平均含量为（34.00±1.05）g/100 g；油菜蜜中葡萄糖含量最高，平均含量为（34.46±2.56）g/100 g；洋槐蜜中葡萄糖含量最低，平均含量为（26.74±0.60）g/100 g。所有蜂蜜样品中果糖和葡萄糖含量之和均大于60 g/100 g，蔗糖含量均小于5 g/100 g，符合GB 14963-2011［1］的要求。

表3 12种糖在5种代表性蜂蜜样品中的含量测定结果Table 3 Determination results of 12 saccharides in 5 types of honey samples

松二糖在所有样品中全部检出，是微量糖分中含量最高的糖类，但在不同蜜种中的分布情况差异较大。由表3可知，15个油菜蜜中松二糖的含量最低，其平均含量为（0.37±0.11）g/100 g；14个枣花蜜中松二糖的含量最高，其平均含量为（2.60±0.36）g/100 g。结果表明，松二糖含量具有一定的蜜种相关性，且与蜂蜜成熟度有关。油菜蜜成熟度一般相对较差，其松二糖含量较低；而成熟度较高的枣花蜜中松二糖含量较高，说明松二糖可以作为一种潜在的蜂蜜内源标志物用于蜂蜜品质评价。

麦芽糖在所有蜂蜜中全部检出，油菜蜜中的麦芽糖含量最低，15个油菜蜜中麦芽糖的平均含量为（0.69 ± 0.17）g/100 g；荆条蜜中麦芽糖含量最高，15 个荆条蜜中麦芽糖的平均含量为（1.88 ±0.26）g/100 g。目前，国家标准尚未给出蜂蜜中麦芽糖含量的限量要求，本文检测数据显示，蜂蜜中均含有少量的麦芽糖，且含量一般不超过3.0 g/100 g，该数据为市场监管机构制定蜂蜜中麦芽糖限量标准提供了数据参考。

吡喃葡糖基蔗糖是蜂蜜中一种微量的三糖，其在油菜蜜中的检出率和含量相对较低，在其余4 种蜂蜜中全部检出，且在荆条蜜、洋槐蜜、枣花蜜中的含量相对较高。麦芽酮糖、曲二糖和异麦芽糖在5种蜂蜜中的分布情况类似，这3种糖在油菜蜜中的检出率均较低，麦芽酮糖和曲二糖仅在个别油菜蜜样品中检出，且含量相对较低；异麦芽糖在15个油菜蜜中全部未检出。麦芽酮糖、曲二糖和异麦芽糖在其余4种蜂蜜中全部检出，其中枣花蜜中这3种糖的含量相对较高。

松三糖、蜜三糖和麦芽三糖在72个蜂蜜样品中检出率极低，蜜三糖和麦芽三糖全部未检出，松三糖在72个蜂蜜样品中有9个样品达到检出限，其平均含量为（0.23±0.03）g/100 g。

3 结 论

本研究采用超高效液相色谱-蒸发光散射检测法（UPLC-ELSD）对蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、松二糖、麦芽酮糖、麦芽糖、曲二糖、异麦芽糖、吡喃葡糖基蔗糖、松三糖、蜜三糖和麦芽三糖含量进行测定。在优化实验条件下，本方法可实现上述12种糖组分的良好分离和定性定量检测，其中果糖和葡萄糖的结果与液相色谱-示差检测法无显著性差异，其余10 种糖的平均回收率为90.0%～105%，相对标准偏差为0.70%～5.8%。该方法操作简便，灵敏度高，准确度和精密度良好，可同时准确定量蜂蜜中12种糖组分。将本法初步用于72批不同蜜种蜂蜜检测，发现松二糖、麦芽糖、麦芽酮糖等糖组分在蜂蜜中普遍检出，检测结果可为蜂蜜品质和质量评价提供重要支撑。