不同提取方法提取黄杨中生物碱的比较研究*

闫玉鑫，金 鑫，杨 艳，丁梦娟

(云南师范大学 职业技术教育学院 应用化学系，云南 昆明 650092)

黄杨属(Buxus)植物全球大约有70多种，我国已知的黄杨属植物有17种，还有几个亚种和变种[1]。它们分布较为广泛，其中云南省共有6种黄杨属植物[2]，包括2种亚种、1种变种及2种栽培种。研究发现，黄杨属植物中含有丰富的环阿廷烷型三萜母核的生物碱，结构独特，且这类生物碱仅在黄杨属植物中分离得到，因而也称为黄杨生物碱 (BuxusAlkaloids)；这类生物碱成分在抗肿瘤、抗菌、抗 HIV、抗乙酰胆碱酯酶等方面有很好的生物活性[3-7]。本文以云南广泛分布、颇具代表性的小叶黄杨及雀舌黄杨作为研究对象，采用薄层色谱(TLC)与高效液相色谱(HPLC)法进行检测、鉴别研究，通过分析不同提取方法、不同提取溶剂、小叶黄杨和雀舌黄杨种间及同一种的枝杆、叶等不同部位中黄杨生物碱的差异，为黄杨生物碱的提取及进一步合理开发利用黄杨属植物资源提供了科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料

实验样品选用的小叶黄杨和雀舌黄杨于2020年10月8日采自云南省昆明市云南师范大学校园内。小叶黄杨、雀舌黄杨的枝叶、叶子、枝杆部分经过干燥，采用微型植物试样粉碎机进行粉碎，粉末经恒温 (60 °C)干燥 24h后，放干燥器中，备用。实验使用的试剂均为分析纯，色谱纯。

1.2 仪器

有WB-2200型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)，N-1100型旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)，R-1001VN型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，SHZ-DⅢ循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，DLSB-5/10低温冷却液循环泵(巩义市子华仪器有限责任公司)，ZF-2三用紫外仪(上海市安亭电子仪器厂)，GM-0.15隔膜真空泵(南开区腾达过滤器件厂)，AL-204电子天平(美国托利多公司)，0.45 μm 微孔过滤膜(津腾实验设备有限公司)，LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)。

2 实验方法

2.1 不同方法提取黄杨生物碱

2.1.1 水煎煮法

称取小叶黄杨枝叶干燥粉末样品 100 g，置于 1000 mL 的烧杯中。分别加入 300 mL 的水溶液煎煮2次，每次煎煮时间为 1 h；过滤，滤液浓缩得浸膏。将浸膏分散在水中，用 0.01 mol/L 稀盐酸调节pH=4，之后放于 500 mL 分液漏斗中；再用与浸膏等体积的乙酸乙酯萃取3次，酸水溶液用10%氨水调至pH=10，用乙酸乙酯萃取2次；合并萃取液;浓缩的总生物碱浸膏，称量，备用。 重复实验3次。

2.1.2 浸渍提取法

称取小叶黄杨枝叶干燥粉末样品 100 g，放入 1000 mL 的锥形瓶中。用 0.0001 mol/L 稀盐酸(pH=4)浸渍药材 2 d；浸渍液加10%氨水，调至pH=10，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，浓缩，称量，备用。 重复3次实验。

2.1.3 回流提取法

称取小叶黄杨枝叶干燥粉末样品6份，每份各称取 100 g，置于 1000 mL 圆底烧瓶中。分别加入 300 mL 甲醇(3份)和乙酸乙酯(3份)，回流提取2次，60 ℃ 水浴，回流 1 h，过滤合并2次滤液，蒸干溶剂，得浸膏。将浸膏分散在水中，用 0.01 mol/L 稀盐酸调节pH=4，放 500 mL 分液漏斗中；再用浸膏等体积的乙酸乙酯萃取3次，酸水溶液用10%氨水调至pH=10，再用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液；浓缩得到总生物碱浸膏，称量，备用。

称取小叶黄杨枝杆、叶干燥粉末样品各3份，每份各称取 100 g，置于 1000 mL 圆底烧瓶中。分别加人 300 mL 甲醇(3份)，回流提取2次，60 ℃ 水浴，回流 1 h，过滤合并2次滤液，蒸干溶剂，得浸膏。将浸膏分散在水中，用 0.01 mol/L 稀盐酸调节pH=4，放入 500 mL 分液漏斗中，再用浸膏等体积的乙酸乙酯萃取3次，酸水溶液用10%氨水调至pH=10，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液；浓缩得到总生物碱浸膏，称量，备用。

称取雀舌黄杨枝杆、叶干燥粉末样品各3份，每份各称取 100 g，置于 1000 mL 圆底烧瓶中。分别加入 300 mL 甲醇，回流提取2次，60 ℃ 水浴，回流 1 h，过滤合并2次滤液，蒸干溶剂，得浸膏。将浸膏分散在水中，用 0.01 mol/L 稀盐酸调节pH=4，放入 500 mL 分液漏斗中，再用浸膏等体积的乙酸乙酯萃取3次，酸水溶液用10%氨水，调至pH=10，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液；浓缩得到总生物碱浸膏，称量，备用。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 TLC样品溶液的制备

称取 2.1 下的各种浸膏约 0.5 g，溶于 10 mL 甲醇，超声溶解 30 min 后，过滤，供TLC点板使用。

2.2.2 HPLC样品溶液制备

移取2.2.1项下的TLC样品溶液 3 mL，定容于 10 mL 容量瓶中，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，备用。分别制备出小叶黄杨枝叶甲醇提取溶液、小叶黄杨枝叶乙酸乙酯提取溶液、小叶黄杨叶甲醇提取溶液、小叶黄杨枝杆甲醇提取溶液、雀舌黄杨叶甲醇提取溶液、雀舌黄杨枝杆甲醇提取溶液。

3 结果与分析

3.1 提取结果

不同提取方法得到的总生物碱浸膏的得率如表1所示。

表1 3种提取方法所得总生物碱浸膏得率

3.2 TLC分析

将2.2.1下的各种样品溶液采用硅胶和氧化铝薄层层析板点样，用石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇溶剂系统展开，在紫外灯下观察样品的展开的情况，然后再在生物碱显色剂(碘化铋钾试剂)显色。对比2.1中的3种提取方法，水煎煮法只有微量的生物碱的点；浸渍法提取的生物碱的含量相对较少；用甲醇溶剂回流提取后，酸溶碱沉处理得到总生物碱含量相对较多，提取效率也高。因此，下一步利用HPLC色谱分析时，主要采用甲醇溶剂回流提取法对黄杨不同种间、不同部位的生物碱成分进行分析。

3.3 HPLC分析

3.3.1 色谱方法

色谱条件： AgilentZORBAXSB-C18色谱柱(φ2.5 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)，1%NH3·H2O(B)；梯度洗脱(0～20 min,60% A；20～40 min，60% A→70% A；40～55 min，70% A→70% A；55～80 min，70%A→100%A；80～100 min，100%A)；流速：1.0 mL/min ；检测波长 225 nm；柱温 30 ℃；进样量 10 μL。

3.3.2 色谱方法学考察

3.3.2.1 色谱条件

为了同时检测小叶黄杨与雀舌黄杨中的生物碱，同时保证有较好的分离效果，考察了洗脱剂甲醇0.5%NH3·H2O、1% NH3·H2O、2% NH3·H2O。结果表明，使用甲醇1% NH3·H2O时的分离效果较好。

3.3.2.2 分析波长

通过对样品实验波长的扫描，得到各样品分别在205、215、225、235、245 nm 处生物碱的峰形情况。检测发现，225 nm 条件下检测灵敏度较高，且干扰峰小，效果较好。因此选择 225 nm 为实验检测波长。

3.3.3 色谱图谱

将2.2.2下的各种样品溶液采用3.3.1色谱条件进样，得到各种溶液的色谱图，见图1～图4。

图1 小叶黄杨枝叶用甲醇和乙酸乙酯回流提取生物碱的色谱图

图2 小叶黄杨叶、枝杆不同部位生物碱的色谱图

图3 雀舌黄杨叶与小叶黄杨叶生物碱含量的色谱图

图4 雀舌黄杨杆与小叶黄杨杆生物碱的色谱图

从图1～图4看出，甲醇和乙酸乙酯两种试剂对回流提取黄杨生物碱有一定的影响，甲醇回流提取的生物碱含量高于乙酸乙酯回流提取；同一种黄杨的不同部位生物碱含量差异较小；小叶黄杨和雀舌黄杨种间生物碱含量差异较大。

4 结语

本研究通过不同提取方法，比较了小叶黄杨、雀舌黄杨中生物碱的含量，结果显示，溶剂加热回流提取法优于水煎煮法和浸渍提取法，甲醇回流提取的生物碱含量大于乙酸乙酯回流提取的生物碱，同一种黄杨的不同部位生物碱含量差异较小，小叶黄杨和雀舌黄杨种间生物碱含量差异较大。