清达颗粒对AngⅡ诱导高血压小鼠肝脏炎症损伤的保护作用

熊晓满，张 铃，2，3，刘 菲，蔡巧燕，2，3，贾沛芝，陈达鑫，2，3，林 炜，2*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福建福州 350122）

长期血压升高是导致心脑血管疾病的重要原因，会损害心、脑、肾等靶向器官，同时也会引起肝脏不同程度的炎症及损伤［1-2］。清达颗粒（Qingda Granule，QDG）是由陈可冀院士临床经验方清眩降压汤精简化裁而来，由天麻、钩藤、黄芩及莲子心组成，具有清肝热、泻心火、舒肝气的功效［3］。前期课题组已经证实QDG 具有较好的降压及保护靶器官作用，同时能显著抑制高血压引起的心脏炎症［4］及LPS 诱导的小胶质细胞炎症反应［5］。然而，QDG 对于高血压引起的肝脏炎症损伤方面作用未见报道，本研究通过构建血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导的高血压小鼠模型，旨在探讨QDG 对AngⅡ诱导的高血压小鼠肝脏炎症的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 18 只雄性SPF 级C57BL/6 小鼠，8 周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养于福建中医药大学动物实验中心。

1.2 实验药物 QDG 由天麻、钩藤、黄芩、莲子心组成，药品为颗粒剂，由江阴天江药业有限公司制备（规格为每袋5 g，批号：1905310）。

1.3 实验试剂 谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；苏木素染色液、伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司）；免疫组化试剂盒、DAB 染色液（迈新生物科技有限公司）。AngⅡ（英国Abcam 公司，货号：ab120183）；小鼠含生长因子样模体黏液样激素样受体（mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1，EMR1，又名F4/80，武汉三鹰生物技术有限公司，货号：28463-1-AP）。

1.4 实验仪器 无创鼠尾血压仪（美国Kent Scientific 公司）；生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；石蜡切片机、生物显微镜（德国Leica公司）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；植入式胶囊渗压泵（美国ALzet 公司）。

2 实验方法

2.1 造模 在小鼠背部后正中线偏右侧做一长约1.5 cm 的纵行皮肤切口，分离皮下组织，将预装好的微量泵以泵头朝向小鼠尾部的方式埋入小鼠背部皮下，以500 ng/（kg·min）持续灌注AngⅡ溶液，连续灌注28 d。将皮肤切口创缘两侧对合后缝合，并消毒创口。将术后小鼠放于保温毯并观察其生命体征，待小鼠清醒后再放回鼠笼。

2.2 分组与干预 将C57BL/6 小鼠按1∶2 随机分为对照组和造模组，造模组按“2.1”项建立高血压模型，对照组运用生理盐水微量泵，余操作同“2.1”项。将造模成功的小鼠随机分为模型组和给药组，每组6 只。QDG 成人临床给药量为10 g/d，按照《中药药理研究方法学》中的剂量估计换算方法，给药组按1.3 g/（kg·d）予QDG 药液灌胃，对照组和模型组予同体积生理盐水灌胃。于造模后第2 天开始给药，连续灌胃28 d。

2.3 测量血压 连接Kent 无创鼠尾血压计，固定小鼠且置小鼠于保温板上，鼠尾连接专用测量器，打开血压测量软件，血压测量20 次循环（预循环5 次），造模前测量1 次基础血压后，每隔1 周测量1 次，连续测量4 周。记录各组小鼠的收缩压、舒张压。

2.4 ELISA 法检测血清ALT、AST、IL-6、TNF-α 表达 造模28 d 后分别取各组小鼠眼底静脉血，静置30 min后，于4 ℃、3 000 r/min下离心15 min，取上清。根据试剂盒操作步骤依次加入对应试剂，最后每孔加入50 μL 终止液，15 min 后用酶标仪于450 nm 波长测定吸光度并记录数值。

2.5 HE 染色法观察肝组织病理形态 药物干预28 d 后，取下各组小鼠的肝右叶于4%多聚甲醛中固定24 h，肝组织取4 cm×4 cm 大小置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ脱水后包埋成石蜡块。将肝组织石蜡块切成4 mm，于37 ℃水中摊开置于载玻片上。60 ℃烤片2 h 后脱蜡，先伊红染色，后苏木素染核，晾干后用中性树胶封片，显微镜下观察并拍片。

2.6 免疫组化法检测肝组织F4/80 表达 肝组织石蜡块以4 mm 切片，60 ℃烤片2 h 后脱蜡，柠檬酸钠法抗原修复，待恢复室温后阻断内源性过氧化物酶10 min，封闭液孵育1 h 后加入F4/80 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，二抗孵育1 h 后加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育1 h，DAB 显色，苏木素复染细胞核，晾干封片后拍片观察。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，采用t 检验；计数资料采用χ2检验。

3 结 果

3.1 3 组小鼠收缩压、舒张压比较 造模后第0 天及第7 天3 组小鼠收缩压及舒张压差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组的收缩压及舒张压在造模后第14、21、28 天间均显著升高（P＜0.05）。给药组能显著降低AngⅡ诱导的高血压小鼠的收缩压及舒张压（P＜0.05）。见表1。

表1 3 组小鼠造模后收缩压、舒张压比较（xˉ±s） mm Hg

3.2 3 组小鼠血清中AST、ALT 含量比较 与对照组比较，模型组血清AST 的表达及AST/ALT 比值均明显升高（P＜0.05），经QDG 给药后AST 表达及AST/ALT 比值明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 3 组小鼠血清中AST、ALT 含量比较

3.3 3 组小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比较 与对照组比较，模型组血清IL-6、TNF-α 的表达明显升高（P＜0.05），经QDG 给药后IL-6、TNF-α 的表达明显降低（P＜0.05），见图2。

图2 3 组小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比较

3.4 3 组小鼠肝脏组织病理形态 对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，而模型组肝组织中炎症细胞浸润明显，肝细胞排列稍紊乱，给药组肝组织病理损伤较模型组明显改善。见图3。

图3 3 组小鼠肝脏组织HE 染色图（×40）

3.5 3 组小鼠肝脏组织F4/80 蛋白表达比较 与对照组比较，模型组肝脏组织中F4/80 的表达明显升高（P＜0.05），经QDG 给药后F4/80 表达明显降低（P＜0.05）。见图4、图5。

图4 3 组肝脏组织F4/80 免疫组化图（×40）

图5 3 组小鼠肝脏组织F4/80 蛋白阳性率比较

4 讨 论

高血压病不属于中医病名，根据其临床症状，归属于“眩晕”范畴。其病位主要为心、肝、肾，病机为肝阳上亢，治法为平肝潜阳、镇肝熄风［6］。本研究中使用的QDG 由天麻、钩藤、黄芩以及莲子心组成，其核心思想是以风眩论治，早治防变。君以天麻平肝熄风，臣以钩藤清热平肝，佐以黄芩清肝泻火，辅以莲子心清心除烦，全方共奏清肝、平肝之效，主治肝阳上亢证型高血压病。药理研究发现该方四味中药及有效成分均具有抗炎作用［7-10］，这些都为QDG 防治高血压及降低肝组织中的炎症反应提供了良好的药效物质基础。

现代研究表明，高血压主要损害心血管系统，导致缺血性心脏病、中风、痴呆、慢性肾脏病等疾病［11］。虽然肝脏不是高血压的靶向器官，高血压导致肝脏疾病也未见报道，但在研究高血压致病过程中发现高血压对肝脏也存在影响。BRUIC 等［12］在自发性高血压大鼠中发现肝脏有明显的氧化应激反应及损伤。研究发现高血压不仅与炎症相关，其更是一种低级别的全身慢性炎症疾病［13］。除外心、脑、肾等炎症反应，BAL 等［14］发现DOCA-盐高血压大鼠肝脏中IκB-α 磷酸化水平升高，炎症细胞的浸润显著增加，表明高血压的发生、发展过程中伴随着肝脏炎症反应。另外，LIU 等［15］研究发现未治疗的高血压男性AST 越高，血压越高，肝转氨酶的水平与舒张压呈正相关。也进一步说明肝脏损伤与血压相关联。而在本研究中，同样发现在AngⅡ造模后小鼠的收缩压及舒张压均升高，血清中的AST 及AST/ALT 比值也显著升高，且病理观察也发现肝脏中炎症细胞浸润明显。F4/80 是一种细胞膜上的糖蛋白，是巨噬细胞特有的标记物，该蛋白表达增加表明巨噬细胞活化，进而引起下游炎症因子表达。模型组小鼠血清中IL-6、TNF-α 表达量增加也佐证炎症反应的发生。而本研究也表明QDG能够在降压的同时，减轻肝组织中炎症细胞的浸润，减少巨噬细胞表面标志物F4/80 的表达，降低血清中AST 表达及AST/ALT 比值。但QDG 有效降压及抑制肝脏炎症反应的具体机制尚未阐明，可进一步结合网络药理学及测序等手段，富集QDG 中的有效活性成分及信号通路，全面探讨QDG 的药效作用机制。