基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的益气健脾颗粒化学成分分析

朱斐 ，谭善忠，王洪兰 ，单晨啸，崔小兵，井山林*，李俊松 *

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

2.江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，江苏 南京 210023

3.南京中医药大学附属南京医院，南京市第二医院中西医结合科，江苏 南京 210003

随着社会的进步，慢性肝病在我国发病率呈逐年上升的趋势，由于其病程长、病情复杂、迁延难愈，给社会和患者造成很大负担[1]。慢性肝病病机复杂，有肝郁气滞、肝郁脾虚等[2]。患者气血不畅，肝脏疏泄条达功能下降，各类管道失其通利，瘀热痰毒阻滞肝络，肝实质长期反复受损，从而形成肝纤维化、肝硬化、肝衰竭等。

益气健脾颗粒由炙黄芪、太子参、当归、酒女贞子等九味药组成，主要用于慢性肝病如肝硬化、肝衰竭等的治疗，在临床应用已有十余年，疗效确切。炙黄芪在方中重用，以补益为主；太子参补气健脾兼可生津，两者共为君药。当归养血活血，酒女贞子滋补肝肾阴精，共为臣药。炒白术、茯苓、陈皮、酒黄芩进一步健脾，同时理气、清热、利湿，补而不滞，为佐药。炙甘草调和诸药，为使药。全方益气健脾治本，清热、利湿、理气治标，标本兼治，共奏固肝气血之本，祛湿热郁之邪之效。将其开发为新药，可以更好地造福患者。

实验室前期进行的药理研究[3]表明，益气健脾方在动物实验中能够有效降低慢加急性肝衰竭模型大鼠的肝损伤相关指标，如谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素等，减轻慢加急性肝衰竭模型大鼠的严重程度；在临床上能够明显改善慢加急性肝衰竭患者肝功能指标，如总胆红素、终末期肝病模型（MELD）评分，提升慢加急性肝衰竭患者免疫功能如外周血淋巴细胞百分百比，改善慢加急性肝衰竭患者预后[4]。

益气健脾颗粒的药理作用已有初步研究，但其发挥药效的物质基础仍不明确，因此，本实验采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术（UPLC-Q-TOF-MS/MS）分别在正、负离子模式下对颗粒剂供试品溶液进行扫描，通过与对照品的保留时间及质谱碎片离子进行匹配，并结合文献报道与自建数据库中对应成分的精确相对分子质量、裂解规律进行比对，对益气健脾颗粒的化学成分进行定性分析，以期为颗粒剂的工艺优化、质量控制、作用机制探讨及深度开发等奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Triple Q-TOF 5600 System-MS/MS电喷雾飞行时间高分辨质谱仪（配备有电喷雾离子源系统，美国AB SCIEX公司），LC-20ADXR快速液相仪（DGU-20A3脱气装置，SIL-20AXR自动进样器，CTO-20AC柱温箱，日本 Shimadzu公司）；数据采集和处理分别采用Analyst TF 1.6和PeakView1.2软件；KH-500DE型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；TD6002C型电子天平（天津天马衡基有限公司）；Sartorius CPA225D型分析天平（南京以马内仪器有限公司）；XP-6型精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Synergy UV系统超纯水仪（南京汉隆仪器有限公司）；HH-8型恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）；TGL-18C-C型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

腺嘌呤（批号S09S10D97125）、烟酸（批号LC15716V）、黄嘌呤（批号AJ0722MA14）、鸟苷（批号AJ0609NA14）、异甘草苷（批号R07D8F50056）、木犀草素（批号YA0408YA13）、芸香柚皮苷（批号P25J9L66554）、野黄芩苷（批号Z01M10X81701）、异甘草素（批号C03A8Q41092）、川陈皮素（批号H22M8K32109）、白杨素（批号X24O6C4947）、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮（批号C09O8Y45293），质量分数均≥98.0%，购自上海源叶生物科技有限公司；尿苷（批号110887-201803）、腺苷（批号110879-201703）、没食子酸（批号110831-200302）、红景天苷（批号110818-201708）、绿原酸（批号110753-201817）、咖啡酸（批号110885-201703）、阿魏酸（批号110773-201915）、甘草苷（批号111610-201908）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201907）、柚皮苷（批号110722-201714）、橙皮苷（批号110721-201617）、黄芩苷（批号110715-201821）、汉黄芩苷（批号112002-201702）、黄芩素（批号111595-201808）、甘草酸铵（批号110731-201619）、藁本内酯（批号4431-01-0）、黄芪皂苷IV（批号110781-201717）质量分数均≥96.8%，购于中国食品药品检定研究院；槲皮素（批号M216C186）、山柰酚（批号K2452C186）质量分数≥98.0%，购自上海吉至生化科技有限公司；毛蕊花糖苷（批号JBZ-7883）、洋川芎内酯A（批号111826-201806）质量分数≥98.0%，购自南京金益柏生物科技有限公司；3,5二咖啡酰奎宁酸（批号DSTDY003601）质量分数≥98.0%，购于成都德思特生物技术有限公司；汉黄芩素（批号64320010）质量分数≥98.0%，购于上海安谱实验科技股份有限公司；黄芪皂苷Ⅲ（批号180419）质量分数≥98.0%，购自南京森贝伽生物科技有限公司。

益气健脾颗粒（批号20210606，实验室自制，黄芪甲苷质量分数为0.067 2 mg/g，红景天苷质量分数为0.228 2 mg/g）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（质谱级，德国Merck公司）；甲醇（分析纯，国药化试集团）；水（屈臣氏蒸馏水与纯水仪自制超纯水）；糊精（分析纯，罗恩试剂）；阿司帕坦（分析纯，批号H10M9A12035，南京景竹生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱为YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～5 min，5% B；5～14 min，5%～23% B；14～25 min，23%～28% B；25～28 min，28%～30% B；28～44 min，30%～34%B；44～51 min，34%～44% B；51～60 min，44%～46% B；60～70 min，46%～56% B；70～80 min，56%～74% B；80～85 min，74%～90% B；85～90 min，90% B，90～92 min，90%～5% B，92～100 min，5% B；体积流量1.0 mL/min；进样量8 μL。

2.1.2 质谱条件 采用TOF MS-IDA-MS/MS模式；正、负离子检测模式；雾化气温度（TEM）：550 ℃；源内气体积流量（GSl，N2）：379.225 kPa；源内气体积流量（GS2，N2）：275.800 kPa；气帘气压力（CUR）：275.800 kPa；喷雾电压（IS）4500 eV（ESI−）、5500 eV（ESI+）；去簇电压（DP）100 eV；碰撞电压（CE）40 eV；碰撞电压差15 eV；扫描范围为m/z50～1500。参数设置、数据采集和分析采用Analyst 1.6 软件。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液的配制 取红景天苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪皂苷IV等对照品适量，精密称定，置于量瓶中，加甲醇制成各对照品储备液；分别吸取各储备液适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度均为10 μg/mL的混合对照品溶液，离心10 min（14 000 r/min），取上清，即得。

2.2.2 供试品溶液的配制 取当归、炒白术、陈皮加6倍量水，浸泡0.5 h，用水蒸气蒸馏法提取挥发油4 h，得挥发油，放置备用，蒸馏后的水溶液另器收集备用；药渣与炙黄芪、太子参等加入全部饮片的10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h，滤过，滤液合并，与蒸馏后的水溶液合并，并于70 ℃减压浓缩至相对密度为1.10～1.20（60 ℃），趁热加入阿司帕坦、糊精适量，干法制粒，制成颗粒，60～70 ℃干燥约1 h，放冷，喷入上述当归挥发油等，混匀，即得。取益气健脾颗粒适量，研细，精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇80 mL，密塞，称定质量，加热回流60 min（85 ℃），放冷至室温，补足减失质量，摇匀，精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，摇匀，离心10 min（14 000 r/min），取上清，即得。此外，按照颗粒剂供试品溶液的生药量，分别取相应比例各单味药饮片，同法制成单味药供试品溶液。

2.3 数据库的建立

在TCMSP、CNKI、SciFinder、ChemicalBook等数据库检索益气健脾颗粒中各药味相关的化学成分信息，整理化合物的CAS号、分子式、相对分子质量、名称、分子结构式（mol格式文件）等，构建益气健脾颗粒的化学成分数据库。

2.4 数据处理、成分鉴别与分析

按“2.1”项下条件检测益气健脾颗粒供试品溶液，将所得原始质谱数据导入PeakView 1.2软件，得到正、负离子模式下的总离子流图（TIC），见图1。对于有对照品进行比对的化合物，将供试品溶液中各成分的相对保留时间、准分子离子、MS/MS碎片离子信息等与对照品图谱比对确认。无对照品比对的的化合物，通过逐个提取选定化合物的谱图与本地自建库中化合物进行匹配，初步比对相对保留时间、相对分子质量、分子式、准分子离子，筛选出误差在5×10−6以内的成分，再将二级谱图中化合物的碎片离子信息与相关文献资料、不同类别成分MS裂解规律进行比对分析，以准确推定无对照品比对的化学成分。

图1 益气健脾颗粒正离子 (A) 和负离子(B) 模式TIC图Fig.1 Total ion chromatograms of Yiqi Jianpi Granules in positive (A) and negative (B) mode

结果从益气健脾颗粒中共鉴定和推测出130个化合物，包括20个含氮化合物类成分、54个黄酮及其苷类成分、22个萜类成分、14个香豆素类成分、12个有机酸类成分和8个其他类成分。其中35个来自黄芪、10个来自太子参、19个来自当归、18个来自女贞子、3个来自白术、16个来自陈皮、3个来自茯苓、14个来自黄芩、33个来自甘草，具体结果见表1。其中38种化合物为多味药共有成分，黄酮类黄芩苷、二氢黄酮类橙皮苷、异黄酮类毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯乙醇苷类红景天苷、有机酸类阿魏酸36个成分与对照品比对后确认。

续表1

续表1

3 主要化合物的鉴定与归属、各类化合物的鉴定分析

3.1 含氮化合物

本实验从益气健脾颗粒中初步鉴定出20个含氮化合物，主要属于氨基酸、核苷类、嘌呤及环肽类，且大多来源于黄芪和太子参。此类化合物的裂解规律一般为以N原子为中心，沿侧链朝苯环方向逐步丢失取代基，进一步脱去氨基，有时也可见苯环开裂[22,39]。如果含有糖类，则容易先失去与其相连的糖分子。氨基酸是一类既含氨基也含羧基官能团的化合物，因此容易发生α-裂解掉落氨基或羧基基团，正离子模式下氨基酸类的准分子离子峰 [M+H]+相对丰度较低[7,43]。

峰12在一级质谱下检测到m/z344.043 6的分子离子峰，二级质谱下检测到丢失1分子的2′,3′-环磷脂基核糖（194）形成的碎片离子m/z150.043 1，在此基础上失去1分子的氨基形成m/z133.016 5碎片，环裂解丢失CH2N2形成m/z108.021 2碎片，结合文献数据[10]推测为环磷酸鸟苷。环肽是由酰胺键或肽键形成的一类环状肽类化合物，容易丢失水、羰基、氨基等碎片。按以上规律，结合文献数据[5-10,30-31]及碎片信息，推测出其余含氮化合物，具体见表1。

3.2 黄酮及其苷类

从颗粒剂中初步推定出54个黄酮类成分，主要来源于甘草、陈皮、黄芪、黄芩。黄酮类化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，在MS谱中裂解规律大多相似，在负离子模式下响应较好。黄酮碳苷类成分常发生糖环的开环裂解，产生 [M-H-60]−、[M-H-90]−和 [M-H-120]−等一系列特征性碎片离子；氧苷类化合物的裂解方式主要是糖苷键的断裂，多见各种糖基如鼠李糖基（Rha，146）、葡萄糖基（Glc，162）和芸香糖基（Rutinose，308）等的掉落。而游离的黄酮苷元则易发生典型的逆狄尔斯-阿德尔（Retro Diels-Alder reaction，RDA）反应裂解，得到151、135、133等特征碎片离子[7]；以及发生C环的重排，可见H2O、C2H2、CH3、OCH3、CO等的掉落[6]。

例如峰40在负离子模式下有m/z285.040 8的准分子离子峰，碎片m/z267.034 2是由其失去1分子水得到，再脱去C2H2得到碎片m/z241.048 5，同时，B环掉落，形成m/z175.041 4的碎片离子，随后发生RDA重排，得到2个互补碎片离子m/z151.003 9与m/z133.030 2，结合文献报道[8]推测为木犀草素。峰67给出了m/z463.161 6 [M-H]−、301.110 5 [M-H-Glc]−的碎片，随后黄烷基母核断裂，形成m/z271.062 1等碎片，依据文献报道[6,44]推测为黄芪紫檀烷苷，可能的裂解途径见图2。根据上述相似规律推定出其余黄酮及其苷类成分，具体见表1。

图2 黄芪紫檀烷苷可能的裂解途径Fig.2 Proposed fragmentation pathway of isomucronulatol 7-O-β-D-glucoside

3.3 萜类

在益气健脾颗粒中共初步推定出22个萜类化合物，萜类为基本碳架多具有2个或2个以上异戊二烯单位（C5单位）结构特征的化合物，有的为游离三萜，有的与糖结合以三萜皂苷的形式存在。环烯醚萜类成分主要存在于女贞子中，三萜酸类化合物主要来自于女贞子、茯苓，三萜皂苷类成分来自于甘草、黄芪。此类化合物容易发生糖苷键的断裂，丢失鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸（GlcA）等糖基，在高能量状态下，常常丢失H2O、CO等中性基团[45-46]，此外苷元碎片上如果连接有甲基、咖啡酰基等基团，则容易产生这些基团掉落的碎片。

例如，峰121检测到m/z785.410 5的分子离子峰，首先丢失1分子葡萄糖基、1分子水，继续脱水得到m/z587.410 5，同时也可以掉落木糖形成m/z473.359 0，继续脱水形成m/z455.356 1，还有m/z143.106 6、125.096 4等碎片，结合文献报道[9,29,36]推测为黄芪皂苷IV，可能的裂解途径见图3。

图3 黄芪皂苷IV可能的裂解途径Fig.3 Proposed fragmentation pathway of astragaloside Ⅳ

3.4 香豆素类

在益气健脾颗粒中里共初步推定出14个香豆素类化合物，主要来源于当归、白术、甘草。这类化合物在正离子模式下响应较高，大多具有强的分子离子峰，其质谱经常出现一系列连续失去-CO、-OH或H2O、CH3或OCH3以及烷基链的碎片离子峰，其中环上的CO比酯键中的更易失去[27]。

例如，峰110在正离子模式下准分子离子为m/z233.153 5 [M+H]+，二级碎片离子分别为m/z215.142 7 [M+H-H2O]+、m/z187.148 3 [M+HH2O-CO]+，分别为依次脱水、掉落1分子CO形成。根据此裂解方式，结合文献报道[26]中碎片信息，推测该化合物为白术内酯Ⅱ。

3.5 有机酸类

从益气健脾颗粒中共初步推定12个有机酸类成分，分别来自当归、黄芪、女贞子。此类化合物在负离子模式下响应较高，特征碎片为小分子基团COOH，可根据羧基相连的基团可划分为脂肪酸和芳香酸2类，芳香酸类一般先产生芳香基团碎片离子，然后掉落H2O、CO2等中性小分子基团；脂肪酸类先丢失H2O、CO2等，随后逐渐脱落甲基、亚甲基等分子[39]。

以峰26为例，准分子离子丢失1分子CO2得到碎片m/z135.045 3 [M-H-CO2]−，继续丢失1分子CO形成碎片m/z107.051 7，最后脱去1分子水得到碎片m/z89.039 5，根据这些特征碎片结合文献报道[19]推测为咖啡酸。以此裂解规律推测其他的有机酸类化合物，具体见表1。

3.6 其他类

此外，在颗粒剂中还推测出蔗糖、醇苷类、鞘脂类等其他成分。其中，红景天苷为典型的苯乙醇苷类 成分，依次掉落葡萄糖基、水分子等碎片。可能的裂解途径见图4。

图4 红景天苷可能的裂解途径Fig.4 Proposed fragmentation pathway of salidroside

4 讨论

中药复方是中药的优势所在，也是中医药的主流与精髓，辨证施治、复方合煎、随方配药无不体现着其中医临床的用药特色，益气健脾颗粒作为医院复方制剂，在临床已应用10余年，疗效确切。但全方药味较多，所含的化学成分非常复杂，本地自建库就收集了500余种化合物，本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术，利用Peakview软件呈现的碎片离子信息，结合网络数据库、自建本地数据库、文献报道等，对益气健脾颗粒所含化学成分进行了分析与归属，为颗粒剂后续的深度优化与开发及探讨其作用机制等研究奠定了理论基础。

该复方治疗慢性肝病的疗效离不开多成分、多机制的协同作用。有文献观察到黄芪水溶性黄酮类对细胞免疫功能具有促进作用[47]，还有文献报道黄芪多糖可升高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，具有一定的保护肝脏的疗效[48]。现代药理学研究表明太子参中主要的活性成分是环肽、多糖、皂苷、氨基酸等，具有改善心功能、调节免疫功能、改善脑缺血及抗氧化等功能[49-50]。当归挥发油可能通过胰岛素相关信号通路等发挥血压调节作用，当归多糖可能通过调节Bax/Bcl-2/Caspase-3等通路，起到保肝作用[51]。已有研究表明[52]，女贞子提取物对肝脏损伤有着显著保护作用，还可通过抑制因子mRNA等的表达有效调控炎症反应。其中齐墩果酸和熊果酸能够有效地抑制丙型肝炎病毒复制酶的活性，对丙型肝炎具有明确的治疗作用。茯苓利水渗湿、健脾健胃等主要功效的发挥与其三萜类、多糖类或有机酸类成分[53-54]。白术的主要有效成分白术多糖，具有明显的防治非酒精性脂肪性肝炎的作用，在改善肝损伤指标方面效果明显[55]，同时，内酯类、挥发油类成分具有抗癌作用[56-57]。陈皮挥发油能松弛气管平滑肌，镇咳作用显著。橙皮苷对蛋白非酶糖基化具有抑制作用，对于肾脏和神经系统并发症方面具有明显的抑制作用[58]。黄芩苷为主的黄酮类是黄芩的主要活性物质，具有广谱的抗菌效果，可解释黄芩具有清热解毒的作用[59]。炙甘草中的甘草多糖，能够加快小鼠的生长，提高脾脏指数和胸腺指数。此外甘草多糖可增加白细胞介素-2的分泌，能促进T细胞等的活化和增殖，并分泌相关因子，进一步改善肿瘤细胞和病毒感染细胞的损伤[60]。结合传统认知中各味药的主要功效及现代药理学研究，可以初步判定，本实验推定的100多种成分可能与颗粒剂发挥益气健脾的作用密切相关。

本研究仍有不足之处，指认出的来源于白术、茯苓的成分较少，可能是由于多糖等大分子不易检出。同时本方中白术、当归、陈皮3味药中挥发油作为主要活性成分之一，却因提取过程中的损失以及LC-MS检测方式的特殊性未能全面分析，许多光学异构的同分异构体也不能清晰辨别。因此，今后可关注GC-MS联用技术指认挥发性成分，入血成分分析等进一步分析益气健脾颗粒的药效物质基础与作用机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突