分心木化学成分及其体外抗肿瘤活性研究

陈 良 ，葛朝伦，魏鸿雁，马晓玲，买迪娜 ，石磊岭*

1.新疆医科大学附属中医医院 药学部 省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830000

2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002

3.中国科学院新疆理化技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830011

4.中国科学院大学，北京 100049

分心木Diaphragma Juglandis Fructus是胡桃科植物胡桃JuglansregiaL.果核内部的干燥木质隔膜，又名胡桃夹、核桃隔膜、胡桃隔、胡桃衣。始载于《山西中药志》，性平，味苦、涩，具有固肾涩精、止血止带之效[1]。传统维医多用其泡水代茶饮，治疗失眠多梦、肾虚等症。现代研究表明，分心木具有抑菌、抗氧化等多种药理活性[2-3]，并含有多种化学成分，是具有很大开发潜力的一味药材。为了进一步研究分心木的物质基础，本实验对分心木95%甲醇提取物进行了系统的分离纯化，得到16个化合物，分别鉴定为isosclerone（1）、engelhardione（2）、5-dehydroxy-octahydro-demethoxycur-cumin-A（3）blumenol A（5）、(+)-erythro-7-Oethylguaiacylglycerol（6）、threo-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3-ethoxypropane-1,2-diol（7）、(6R,9R)-blumenol B（8）、hexahydro-demethoxycurcumin-A（9）、blumenol C（10）、3,4-二羟基苯甲酸乙酯（ethyl 3,4-dihydroxybenzoate，11）、(+)-异落叶松脂醇[(+)-isolariciresinol，12]、胡桃宁 B（juglanin B，13）、heptanoid（14）、4,17-dimethoxy-2-oxatricyclo [13.2.2.13,7] eicosa-3,5,7(20),15,17,18-hexaene-10,16-diol（15）、alternariol 9-methyl ether（16）。以上化合物均为首次从分心木中分离得到。为进一步探究分心木的有效成分，本实验对化合物1～16进行了抗肿瘤活性筛选，结果显示，化合物9、13对人子宫颈癌HeLa细胞表现出抑制作用，化合物13对人胃癌HGC-27细胞细胞表现出一定的活性，其余化合物尚未表现出明显对这2种癌细胞的抑制活性。

1 仪器与材料

BrukerAvanceIII600型核磁共振波谱仪（德国Bruker），赛默飞世尔（Thermo Fisher）LTQ-Obitrap XL液质联用仪，制备型Agilent高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱柱YMC-Pack ODS-A（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司），Sephadex LH-20凝胶（Pharmacia公司），MCI填料（日本三菱化学公司），柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司），薄层色谱用硅胶G、H、GF254（青岛海洋化工有限公司），常规试剂均为分析纯。HeLa细胞、HGC-27细胞购自sigma-aldrich公司

分心木采购于新疆和田药材市场，经新疆中药民族药研究所贾晓光研究员鉴定为胡桃科植物胡桃J.regiaL.果核内部的干燥木质隔膜。

2 提取与分离

分心木8.34 kg，粉碎为粗粉，用体积分数95%甲醇加热回流提取，减压浓缩得753 g总浸膏。总浸膏用水分散处理后，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇进行萃取至无色，萃取液减压浓缩至干，得到石油醚部位总浸膏45.8 g、氯仿部位总浸膏47.6 g、醋酸乙酯部位总浸膏159.8 g、正丁醇部位总浸膏93.5 g。取氯仿部位（47.6 g）经硅胶（100～200目）柱色谱，氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脱得到11个流分Fr.1～11。

Fr.3（氯仿-甲醇90∶1）经过MCI色谱柱，薄层色谱检测，合并得到5个组分Fr.3-1～3-5。Fr.3-1经半制备液相色谱（46%甲醇）分离纯化，得到化合物6（5.7 mg）、7（1.6 mg）、8（1.2 mg）。Fr.3-2经半制备液相色谱（53%甲醇）分离纯化，得到化合物4（2.2 mg）、5（5.7 mg）。Fr.3-3经半制备液相色谱（72%甲醇）分离纯化，得到化合物11（1.2 mg）。Fr.3-4经半制备液相色谱（78%甲醇）分离纯化，得到化合物9（6.9 mg）、10（8.6 mg）。Fr.3-5经半制备液相色谱（90%甲醇）分离纯化，得到化合物3（5.7 mg）。Fr.5（氯仿-甲醇60∶1）经过Sephadex LH-20凝胶色谱柱，得到5个组分Fr.5-1～5-5。Fr.5-2经半制备液相色谱（52%甲醇）分离纯化，得到化合物12（1.9 mg）。Fr.5-5经半制备液相色谱（48%甲醇）分离纯化，得到化合物1（1.5 mg）、2（1.0 mg）。Fr.6（氯仿-甲醇40∶1）经ODS反相色谱柱分离，得到6个组分Fr.6-1~6-6。Fr.6-3经半制备液相色谱（60%甲醇）分离纯化，得到化合物13（8.5 mg）。Fr.6-4经半制备液相色谱（65%甲醇）分离纯化，得到化合物14（1.2 mg）、15（1.1 mg）、16（1.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物2：无色结晶（甲醇）。mp 73～76 ℃。ESI-MSm/z: 335 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C19H20O4。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 2.84 (2H, m, H-1), 2.32 (2H, m, H-2), 1.87(2H, m, H-4), 1.54 (2H, m, H-5), 1.69 (2H, m, H-6),2.68 (2H, m, H-7), 5.59 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-2′), 6.72(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.56 (1H, dd,J= 8.4, 2.4 Hz, H-6′), 6.86 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2′′), 6.84 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-5′′), 6.79 (1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz,H-6′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 28.4 (C-1),42.4 (C-2), 213.3 (C-3), 47.6 (C-4), 20.5 (C-5), 28.4(C-6), 36.8 (C-7), 134.6 (C-1′), 114.1 (C-2′), 149.8(C-3′), 143.2 (C-4′), 117.2 (C-5′), 122.9 (C-6′), 141.4(C-1′′), 119.9 (C-2′′), 145.1 (C-3′′), 141.5 (C-4′′),125.3 (C-5′′), 123.1 (C-6′′)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化合物2为engelhardione。

化合物3：无色油状物。ESI-MSm/z: 353 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT 谱确定分子式为C20H26O4。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.56(2H, m, H-1), 1.84 (2H, m, H-2), 3.62 (1H, m, H-3),1.54 (2H, m, H-4), 1.51 (1H, m, H-5a), 1.37 (1H, m,H-5b), 1.63 (2H, m, H-6), 2.45 (2H, t,J= 7.8 Hz,H-7), 6.63 (1H, d,J= 1.2 Hz, H-2′), 6.95 (1H, d,J=8.4 Hz, H-5′), 6.54 (1H, dd,J= 8.4, 1.2 Hz, H-6′),7.04 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′′, 6′′), 6.71 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-3′′, 5′′), 3.72 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 30.6 (C-1), 38.5 (C-2), 68.9 (C-3),37.0 (C-4), 25.1 (C-5), 31.5 (C-6), 34.8 (C-7), 132.5(C-1′), 112.4 (C-2′), 147.3 (C-3′), 155.1 (C-4′), 115.0(C-5′), 120.2 (C-6′), 133.2 (C-1′′), 129.6 (C-2′′, 6′′),115.2 (C-3′′, 5′′), 155.1 (C-4′′), 55.5 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物3为5-dehydroxy-octahydro-demethoxycurcumin-A。

化合物4：白色结晶（甲醇）。mp 211～213 ℃。ESI-MSm/z: 295 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C16H16O4。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.20 (2H, d,J= 1.8 Hz, H-2, 2′), 6.86(2H, d,J= 8.4 Hz, H-5, 5′), 7.11 (2H, dd,J= 8.4, 1.8 Hz, H-6, 6′), 6.78 (2H, s, H-7, 7′), 3.73 (6H, s, 3,3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 130.5(C-1, 1′), 109.4 (C-2, 2′), 147.3 (C-3, 3′), 144.7 (C-4,4′), 115.2 (C-5, 5′), 120.3 (C-6, 6′), 127.6 (C-7, 7′)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物4为(E)-3,3′-dimethoxy-4,4′-dihydroxystilbene。

化合物5：白色粉末（甲醇）。mp 118～122 ℃。ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT 谱确定分子式为C13H20O3。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 2.37 (1H, d,J= 16.8 Hz, H-2a), 2.07(1H, d,J= 16.8 Hz, H-2b), 5.78 (1H, s, H-4), 5.66(1H, d,J= 15.6 Hz, H-7), 5.71 (1H, dd,J= 15.6, 4.8 Hz, H-8), 4.18 (1H, m, H-9), 1.11 (3H, d,J= 6.6 Hz,H-10), 0.91 (3H, s, Me-11), 0.93 (3H, s, Me-12), 1.80(3H, d,J= 1.2 Hz, Me-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 40.9 (C-1), 49.4 (C-2), 197.4 (C-3),125.5 (C-4), 164.4 (C-5), 77.8 (C-6), 135.8 (C-7),127.9 (C-8), 66.1 (C-9), 24.1 (C-10), 23.0 (C-11), 23.9(C-12), 19.0 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物5为blumenol A。

化合物8：无色油状物。ESI-MSm/z: 249 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C13H22O3。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.06(1H, d,J= 18.0 Hz, H-2a), 2.48 (1H, d,J= 18.0 Hz,H-2b), 5.74 (1H, s, H-4), 1.63 (1H, m, H-7a), 1.80(1H, m, H-7b), 1.25 (1H, m, H-8a), 1.52 (1H, m,H-8b), 3.49 (1H, m, H-9), 1.03 (3H, d,J= 6.6 Hz,H-10), 1.93 (3H, d,J= 1.2 Hz, H-11), 1.00 (3H, s,H-12), 0.91 (3H, s, H-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 41.4 (C-1), 49.8 (C-2), 196.7 (C-3),125.0 (C-4), 168.5 (C-5), 77.0 (C-6), 34.1 (C-7), 34.0(C-8), 66.4 (C-9), 24.2 (C-10), 21.1 (C-11), 23.5(C-12), 23.6 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物8为 (6R,9R)-blumenol B。

化合物9：无色油状物。ESI-MSm/z: 351 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C20H24O5。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 2.84(2H, m, H-1), 2.68 (2H, m, H-2), 2.56 (2H, m, H-4),4.06 (1H, m, H-5), 1.78 (1H, m, H-6a), 1.49 (1H, m,H-6b), 2.64 (1H, m, H-7a), 2.47 (1H, m, H-7b), 6.65(1H, d,J= 2.4 Hz, H-2′), 6.97 (1H, d,J= 7.8 Hz,H-5′), 6.55 (1H, dd,J= 7.8, 2.4 Hz, H-6′), 7.17 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-2′′, 6′′), 6.65 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-3′′,5′′), 3.73 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 20.1 (C-1), 44.7 (C-2), 209.2 (C-3), 50.4(C-4), 66.2 (C-5), 40.0 (C-6), 30.9 (C-7), 133.3 (C-1′),112.4 (C-2′), 147.4 (C-3′), 144.4 (C-4′), 115.0 (C-5′),120.3 (C-6′), 132.9 (C-1′′), 129.1 (C-2′′, 6′′), 115.3(C-3′′, 5′′), 155.4 (C-4′′), 55.5 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物9为hexahydrodemethoxycurcumin-A。

化合物10：淡黄色油状物。ESI-MSm/z: 233[M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C13H22O2。1H-NMR (600 MHz DMSO-d6)δ: 2.34(1H, d,J= 17.4 Hz, H-2a), 2.00 (1H, d,J= 17.4 Hz,H-2b), 5.71 (1H, s, H-4), 3.53 (1H, m, H-9), 1.04 (1H,d,J= 6.0 Hz, H-10), 0.93 (1H, s, H-11), 0.99 (1H, s,H-12), 1.95 (1H, s, H-13)；13C-NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 36.4 (C-1), 47.4 (C-2), 198.5 (C-3),124.6 (C-4), 166.4 (C-5), 50.6 (C-6), 26.1 (C-7), 38.9(C-8), 66.3 (C-9), 24.1 (C-10), 27.2 (C-11), 28.9(C-12), 24.5 (C-13)。以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物10为blumenol C。

化合物11：白色粉末（甲醇）。mp 132～134 ℃。ESI-MSm/z: 205 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT 谱确定分子式为C9H10O4。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 7.35 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2), 7.31 (1H,d,J= 7.8 Hz, H-5), 6.80 (1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz,H-6), 4.22 (2H, m, H-2′), 1.27 (3H, t,J= 7.2 Hz,H-3′)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 121.7 (C-1),116.2 (C-2), 150.4 (C-3), 145.0 (C-4), 115.3 (C-5),120.7 (C-6), 165.7 (C-1′), 60.0 (C-2′), 14.3 (C-3′)。以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物11为3,4-二羟基苯甲酸乙酯。

化合物16：黄色针状结晶（甲醇）。mp 267～270 ℃。ESI-MSm/z: 295 [M+Na]+，结合13C-NMR、APT谱确定分子式为C15H12O5。1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 6.71 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-2), 6.62 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-4), 6.56 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-8), 7.29(1H, d,J= 1.8 Hz, H-10), 2.77 (3H, s, 1-CH3), 3.93(3H, s, 9-OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:140.1 (C-1), 118.8 (C-2), 160.2 (C-3), 103.0 (C-4),167.3 (C-6), 99.8 (C-6a), 166.7 (C-7), 100.2 (C-8),168.4 (C-9), 105.1 (C-10), 139.9 (C-10a), 111.0(C-10b)。以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物16为alternariol 9-methyl ether。

4 体外抗肿瘤活性

将对数生长期的HeLa细胞和HGC-27细胞分别接种于96孔板上，每孔100 μL，在培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养24 h。待细胞贴壁后，实验组加入药物，使终质量浓度为50 μg/mL，阳性对照组加入等量的顺铂（DDP），对照组加入稀释250倍的二甲基亚砜（DMSO），在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育48 h后，分别加入MTT（0.5 mg/mL）继续培养4 h，取出吸去上清液，加入DMSO 150 μL震荡溶解，在酶标仪570 nm测定吸光度（A）值，根据A值计算半数抑制浓度（median inhibitory concentration，IC50）。

实验以DDP（50 μmol/L）为阳性对照药，检测了16个化合物对HeLa细胞和HGC-27细胞的体外抑制活性。结果表明化合物9、13可明显抑制HeLa细胞，化合物13对HGC-27细胞表现出一定的抑制活性，其余化合物未检出有抑制活性。其IC50值见表1。

表1 化合物9、13对HeLa细胞和HGC-27细胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of compounds 9 and 13 on HeLa and HGC-27 cells

5 讨论

分心木为核桃果核内的木质隔膜，在民间药用历史悠久，维吾尔族百姓素有将其泡水代茶饮的习惯，有着良好的安眠和益肾的功效，具有良好的开发和应用前景[19]。并且其成分丰富，但目前对于分心木的相关研究仍然不够透彻。本实验通过色谱方法结合波谱法，从分心木中首次分离了16个化合物，通过MTT法考察了所有化合物对肿瘤细胞的体外抑制活性，结果提示分心木具有潜在的抗肿瘤活性，旨在为分心木的新药开发提供了物质基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突