气相色谱法测定食品中4种对 羟基苯甲酸酯类含量

◎ 燕 群，党翠红，张 育

（咸阳市食品药品检验检测中心，陕西 咸阳 712000）

对羟基苯甲酸酯又称尼泊金酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯等，是一类高效的防腐剂，对霉菌、酵母及细菌有广泛的抗菌作用，其抗菌作用比苯甲酸、山梨酸强，在食品、饮料、化妆品和医药等许多行业广泛应用[1-3]。对羟基苯甲酸酯类的作用机制基本上与苯酚类类似，能够破坏微生物的细胞膜，使细胞内蛋白质变性，并抑制微生物细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性。与传统的苯甲酸、山梨酸防腐剂相比，对羟基苯甲酸酯类的防腐效果不易随pH值的变化而变化，在碱性环境下尚有效，而且其毒性远低于苯甲酸钠和山梨酸钾[4]。严格按照标准剂量添加对人体无害，然而过量使用可能会产生类雌激素风险，导致内分泌系统紊乱，对人体产生一定的毒副作用，威胁人体健康，因此对食品中对羟基苯甲酸酯类的检测尤为重要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食醋、酱油、茶饮料（均购于超市）；无水乙醇（色谱纯，美国默克两合股份有限公司）；无水乙醚、盐酸、氯化钠、无水硫酸钠和碳酸氢钠（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；对羟基苯甲酸甲酯（99.9%，CAS号：99-76-3）、对羟基苯甲酸乙酯（99.5%，CAS号：120-48-7）、对羟基苯甲酸丙酯（99.7%，CAS号：94-13-3）和对羟基苯甲酸丁酯（99.8%，CAS号：94-26-8），CATO Research Chemicals Inc。

1.2 仪器与设备

气相色谱仪，GC-2010 Plus（日本岛津有限公司），配氢火焰离子化检测器（FID），InterCap 5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，日本岛津有限公司）；AUY-120电子天平(日本岛津有限公司)；氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

进样口气化室温度：220 ℃；分流比10∶1；线速模式74.9 MPa；检测器：FID 温度260 ℃；升温程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃·min-1升到170 ℃，以 12 ℃·min-1升到220 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升到250 ℃，保持6 min；载气流量：氢气40.0 mL·min-1，空气400.0 mL·min-1，尾吹流量40.0 mL·min-1。

1.3.2 标准溶液配制

分别准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯标准品各0.5 g（精确至0.1 mg）于4个25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，得到浓度为20 mg·mL-1的单标储备液。然后再分别吸取2.5 mL单标储备液于50 mL容量瓶中，无水乙醇稀释并定容至刻度，得到浓度为1 mg·mL-1的混合标准中间液，临用时配制。再将混合标准中间液稀释为1.0 μg·mL-1、1.5 μg·mL-1、 2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、 20.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1和100.0 μg·mL-1的混合标准系列工作液，临用时配制。

1.3.3 样品前处理

称取均质后的样品5 g（精确至0.01 g）于小烧杯中，并转移至分液漏斗中，用饱和氯化钠溶液分次洗涤小烧杯并将洗涤液转移至分液漏斗中，加入1 mL盐酸（1∶1）酸化，摇匀，再分别以75 mL、50 mL、50 mL无水乙醚提取3次，合并乙醚层于另一分液漏斗中，加入10 mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再以碳酸氢钠溶液30 mL、30 mL、30 mL洗涤3次，弃去水层，将有机层经过无水硫酸钠滤入浓缩瓶中，旋蒸浓缩近干，氮吹除去溶剂残留，准确加入2.0 mL无水乙醇溶解残留物，过膜、上机、待测[5]。

1.3.4 检出限评估

（1）目视评价法评估检出限。目视评估法是通过在样品空白中添加已知浓度的分析物，然后确定能够可靠检测出分析物最低浓度值的方法[6]。参考标准《食品安全国家标准 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定》（GB 5009.31—2016），对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的检出限均为0.6 mg·kg-1。称取基质样品（酱油）2份各0.5 g（精确至0.01 g），分别加入20 μL、30 μL对羟基苯甲酸酯类混合标准中间液（100 μg·mL-1），即加入的对羟基苯甲酸酯类的含量为0.4 mg·kg-1、 0.6 mg·kg-1，经样品前处理分析后，进气相色谱仪分析，连续测定7次，按照以下公式计算检出限：

式中：Xi为试样中对羟基苯甲酸的含量，mg·kg-1；C为由标准曲线计算出进样液中对羟基苯甲酸脂类的浓度，μg·mL-1；m为试样质量，g；V为定容体积，mL；f为换算系数。

（2）信噪比法评估检出限。对于定量方法来说，由于仪器分析过程都会有背景噪音，常用已知低浓度的分析物样品与空白样品的测量信号进行比较，确定可靠的最小检出浓度。典型的可接受的信噪比是2∶1或3∶1[6]，本次检出限以3倍信噪比计。按照以下公式计算检出限：

式中：LOD为检出限，mg·kg-1；C为试样中对羟基苯甲酸脂类的浓度，μg·mL-1；S/N为试样中对羟基苯甲酸脂类浓度对应的仪器信噪比。

2 结果与分析

2.1 色谱图

在上述色谱条件下，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的出峰顺序和保留时间见图1，可以看出分离效果好，响应值大，能较好地定性。

2.2 检出限分析

参考《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中5.4.2.2确定检出限的方法，本次选择目视评价法和信噪比法评估检出限。

表1为添加量为0.4 mg·kg-1的测定结果，表2为添加量为0.6 mg·kg-1的测定结果，表3为两种方法结果比较，经综合评估，选用较大的值作为检出限。对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的检出限分别为0.489 8 mg·kg-1、 0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1，均小于GB 5009.31—2016的方法检出限。

表1 添加量为0.4 mg·kg-1的测定结果表（n=7）

表2 添加量为0.6 mg·kg-1的测定结果表（n=7）

表3 两种方法检出限结果比较表

2.3 校准曲线

分别取混合标准系列工作液上机测定，4种对羟基苯甲酸酯类的峰面积和质量浓度在0~100 μg·mL-1呈现良好的线性关系。相关系数均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录 F.2校准曲线[7]不低于0.99的规定。其线性关系良好，可以较好的用于定量分析。数据如表4所示。

表4 4种对羟基苯甲酸酯类的峰面积及相关系数表

2.4 加标回收率

称取样品，对3种样品在3个添加水平下加标，同等条件下重复测定两次，计算RSD。按照1.3.3进行前处理，加标回收率及RSD见表5。结果显示，3种样品在3个添加水平下能得到较高的加标回收率，为91.0%～101.0%，符合GB/T 27404—2008附录F.1回收率[7]的规定，且RSD值较小，能满足定量检测的要求。

表5 4种对羟基苯甲酸酯类加标回收率表

2.5 精密度

对同一浓度点5.0 μg·mL-1混合标准溶液平行测定7次，数据见表6。实验室内变异系数CV/符合 GB/T 27404—2008附录F.3精密度的规定[7]。

表6 4种对羟基苯甲酸酯类精密度表（n=7）

3 结论

用气相色谱毛细管柱法测定食品中对羟基苯甲酸酯类，结果显示对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的校准曲线相关系数分别为0.999 8、0.999 8、0.999 9和0.999 9；检出限分别为0.489 8 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1、0.400 0 mg·kg-1和0.400 0 mg·kg-1；精密度分别为0.93%、1.54%、1.99%和0.83%；加标回收率为91.2%～101.0%，符合 GB/T 27404—2008和GB/T 27417—2017的要求。表明该方法分离效率高、分析结果准确，可以适用于食品中对羟基苯甲酸酯类的检测。