猴头菌菌丝体发酵条件优化研究

鞠正福 周巨川 董国秀

（1 青岛市城阳区上马街道办事处农业农村服务中心，山东青岛266112；2 青岛蓝佳生物科技有限公司，山东青岛266112）

猴头菌Hericium erinaceus，别名猴头蘑、羊毛菌、猴头菇，属真菌界，担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，齿菌科，猴头菌属。猴头菌是一种腐生菌，子实体为团块状、质地柔软，子实体的中部和中下部为圆柱状菌针，全形似刺猬或猴头，子实体初期为白色，干后呈浅褐色，孢子呈球形，光滑无色[1-2]。

猴头菌是一种药食两用菌，含多糖类及氨基酸，并含多肽类及草菌酸[3]。研究表明，猴头菌不仅对消化系统疾病有特殊疗效，而且还具有增强免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、保护神经和抗菌作用[4]。

猴头菌人工栽培技术已较为成熟，但生产周期长、产量低且不稳定。发酵培养猴头菌菌丝体，成本低，周期短，产量高。目前关于猴头菌深层发酵有关研究报道的结论还不完全一致[5-9]，刘艳芳等[5]研究得出最优培养基主要为葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母膏1%；刘灵霞[6]研究得出液体培养猴头菌的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨；刘晓鹏等[8]报道可溶性淀粉和黄豆粉分别为最佳的碳源和氮源；信文娟等[9]筛选出葡萄糖3%，山药粉0.4%，花生粉1%，玉米浆干粉0.6%为猴头菌发酵培养的最优培养基。由此可见，不同研究者得出的猴头菌液体培养基配方存在很大差异。

试验以猴头菌菌丝体干重为评价指标，对猴头菌液体培养基进行优化，提高其菌丝体产量，为猴头菌相关产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）菌株：猴头菌菌株CGMCC5.783，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

（2）培养基：斜面培养基采用PDA 培养基，取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL 煮沸30 min，滤去马铃薯块，加葡萄糖20 g，琼脂20 g，加蒸馏水将滤液补足至1 000 mL，pH自然，115 ℃灭菌30 min。

液体种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，Mg‐SO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.15%，pH 自然，250 mL 三角瓶装液量100 mL，115 ℃灭菌30 min。

（3）主要仪器设备：JL2004B 分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）、TMHS-50 恒温恒湿培养箱（常州托曼仪器制造有限公司）、YXQ-LS-50S 型立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、ZW-QH23 组合式振荡培养箱（常州金坛中旺仪器制造有限公司）、YT-700 型电热恒温鼓风干燥箱（绍兴沪越仪器设备有限公司）。

1.2 培养方法

1.2.1 猴头菌斜面的制备

将0.5 cm2的猴头菌菌丝块接种于PDA 斜面培养基中，置于26 ℃培养箱中培养10 d，备用。

1.2.2 液体种子培养

在无菌条件下，将4 块0.5 cm2的斜面猴头菌菌丝接入装有100 mL液体种子培养基的摇瓶中，置于转速为150 r/min 的摇床上26 ℃振荡培养7 d，再次接入液体种子培养基中，相同条件下培养7 d，备用。

1.2.3 发酵培养

将约7 d菌龄的菌种接入装有100 mL 发酵培养基的摇瓶中（250 mL 三角瓶装液量100 mL）接种量为10%，置于26 ℃，转速为150 r/min 摇床上振荡培养10 d。

1.2.4 碳源筛选试验

碳源主要考察对象为迟效碳源，为满足菌丝体初期生长的养分需求，故添加葡萄糖10 g/L，另外添加蛋白 胨5 g/L，MgSO4·7H2O1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，在此基础上分别添加可溶性淀粉、玉米粉（煮沸30 min，4 层纱布过滤取滤液，以下玉米粉处理相同）、甘蔗糖蜜、蔗糖、红糖和甘油，添加量均为30 g/L，pH 5.5，在115 ℃条件下灭菌30 min。每个碳源处理3个重复。

1.2.5 氮源筛选试验

葡 萄 糖 30 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41.5 g/L、VB10.01 g/L，在此基础上分别添加酵母粉、黄豆粉（煮沸30 min，4 层纱布过滤取滤液，以下黄豆粉处理相同）、豆粕粉、蛋白胨、牛肉粉，添加量均为10 g/L，pH 5.5，在115 ℃条件下灭菌30 min。每个氮源处理3个重复。

1.2.6 碳氮源正交试验

选取碳源葡萄糖和玉米粉，氮源酵母粉和黄豆粉为因素进行正交优化试验，正交表选用L9（34），正交设计见表1。每个处理3个重复。

表1 碳氮源正交因素和水平 单位：g/L

1.3 菌丝体测定方法

用50 μm滤膜抽滤收集菌丝体，称湿重并记录，于60 ℃烘箱中干燥28 h至恒重，记录菌丝体干重。

2 结果与分析

2.1 供试碳源对猴头菌菌丝体生物量的影响

由图1 可知，以玉米粉为碳源的培养基获得的猴头菌菌丝体生物量（菌丝干重，下同）最高（1.39%），以甘油为碳源的培养基培养的菌丝体生物量最低。由此可知，猴头菌对玉米粉的利用率最高，对甘油的利用率最低。葡萄糖是速效碳源，能够在菌丝体生长初期快速提供碳源，玉米粉作为迟效碳源，在菌丝体生长后期有明显的促进菌丝生长作用，所以最佳碳源选择玉米粉和葡萄糖复配进行正交试验。

图1 供试碳源对猴头菌菌丝体生物量的影响

2.2 供试氮源对猴头菌菌丝体生物量的影响

以往研究表明，无机氮源不宜用于真菌培养[9]，故试验全部用有机氮源。

由图2 可知，以黄豆粉为氮源的培养基获得的猴头菌菌丝体生物量最高（1.41%），酵母粉其次，以蛋白胨为氮源的培养基获得的菌丝体生物量最低。故选择黄豆粉和酵母粉复配进行正交试验。

图2 供试氮源对猴头菌菌丝体生物量的影响

2.3 复合碳氮源的正交试验结果

图3 菌丝体发酵培养前期（左为第一次培养液体种子，右为转接后液体种子）

图4 菌丝体发酵培养后期（培养第9天）

图5 过滤后菌丝体（验证试验）

由表2 可知，组合5 的猴头菌菌丝体干重最高，所对应培养基为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉12.5 g/L，黄豆粉5 g/L。从K值分析看出各因素最大K值对应的试验组合为A2B2C2D1，所对应的因素水平为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黄豆粉5 g/L。从R值看出RA＞RB＞RD＞RC，即四因素影响力大小比较为玉米粉＞葡萄糖＞黄豆粉＞酵母粉。

表2 复合碳氮源的正交试验结果

由表3 正交试验方差分析的F值可知，与其他因素相比玉米粉对猴头菌菌丝体干重影响有显著性差异。从F值大小比较四因素之间影响力大小，与表2中R值分析结果一致。

表3 复合碳氮源的正交试验结果方差分析

从K值可知，最优组合为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黄豆粉5 g/L，并不在9 组试验内，对该组合重复3次验证试验，获得菌丝体干重平均为25.1 g/L。

3 小结与讨论

碳源是食用菌重要营养之一，单糖（如葡萄糖）可以直接被吸收，有利于菌丝体生长初期吸收利用。复合碳源原料具有资源丰富、成本低廉的优点，是规模化生产的首选，所以最佳碳源选择复配玉米粉和葡萄糖。

从菌丝体营养需求来看，氮源是最重要的营养来源，是合成氨基酸和核酸不可缺少的原料。氮源不足会严重影响菌丝体的生长。大多数食用菌利用有机氮的能力优于利用无机氮[6]，复合氮源比单一组分氮源培养菌丝的生物量高，因为有机氮中含有一些微量元素，如金属元素和生长因子等可促进菌丝体生长。

由单因素试验和正交试验最终确定适宜猴头菌菌丝体生长的液体培养基为玉米粉30 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，黄豆粉5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，验证试验获得猴头菌菌丝体干重为25.1 g/L。

试验结果为猴头菌液体培养菌丝体提供数据支撑。