响应面法优化金针菇漆酶产酶条件

张嘉清 牛 丽 单玉虹 张天宇 唐小婷 王 越张建伟 马懿贤 王 霞 王盼盼 冯九海 梁倩倩 丁玲强

（1河西学院农业与生态工程学院，甘肃张掖734000；2河西学院生命科学与工程学院，甘肃张掖734000；3河西学院甘肃省应用真菌工程实验室，甘肃张掖734000）

漆酶（laccase）是一类含铜的多酚氧化酶[1]。近年来，在对漆酶性质和作用进行研究后发现，漆酶在食品工业、造纸业、环境保护过程中都起着重要的作用，从而促进了漆酶的进一步研究[2]。据研究发现，不同食用菌产漆酶的能力也不同，食用菌产漆酶能力与其培养周期有关，产漆酶能力强的菌株，其液体发酵培养的周期短；而产漆酶能力较弱或者是不产漆酶的菌株，液体发酵培养的周期长[3]。但是目前漆酶的应用潜力还未得到充分挖掘，主要原因在于现有漆酶的低催化效率和高生产成本[4]。目前漆酶的工业化还需在缩短预处理周期、研制高效的经济介体、实现大规模生产等方面加强研究[5]。其中实现大规模生产是漆酶工业化的重要内容之一。

响应面法（RSM）能够在有限的次数内，对影响生物过程的关键因子及其交互作用进行优化、评价，以获得影响过程的最佳条件，已成功应用于种子培养基以及发酵条件的优化[6]。笔者以漆酶产量较高的金针菇闽金1 号为材料，采用P-B（plackettburma）设计、响应面法、中心组合试验CCD（central composite design，）设计优化营养培养基组成，考察碳源、氮源、Cu、K+、VB1[7]等因素对金针菇漆酶分泌的影响，寻找适宜的营养及培养条件，以提高金针菇闽金1 号分泌漆酶的能力，为其进一步开发利用和相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

金针菇菌株：闽金1号，由河西学院应用真菌工程实验室提供。

主要试剂：ABTS[2，2’‐azino‐bis（3‐ethylbenzo thiazoline‐6‐sulfonic）]购自Sigma 公司，蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、酒石酸铵、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、麸皮、MgSO4、KH2PO4、VB1、CuSO4等均为国产分析纯。

主要仪器：SF-CJ-2 A 净化工作台（扬州市三发电子有限公司），HZQ-X400 恒温振荡培养箱（华美生化仪器厂），日本立洋移液枪（上海泽权仪器设备有限公司），DKB-501 恒温水浴锅（扬州三发电子有限公司），LRH-500-D恒温培养箱（韶关市泰虫医疗器械有限公司），CL-32 L 蒸汽灭菌锅（日本ALP 公司），数显恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司），SP-722 型分光光度计（上海光谱仪器有限公司），TCL-20M 台式高速冷冻离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司），IMS-50制冰机（江苏格林电器有限公司），BK-FL 荧光倒置显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）。

1.2 供试培养基

固体培养基：马铃薯200 g，麸皮30 g，磷酸二氢钾1 g，蛋 白 胨4 g，葡 萄 糖20 g，琼 脂20 g，水1 000 mL，pH 自然，115 ℃灭菌20 min。基础产酶培养基：马铃薯200 g，麸皮30 g，磷酸二氢钾1 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 自然，115 ℃灭菌20 min。

1.3 菌液制备

将供试菌株接种于平板固体培养基，25 ℃活化培养5 d；用0.8 cm 打孔器取活化后的菌饼三块，接种于装液量80 mL 的液体培养基三角瓶（250 mL）中，25 ℃、120 r/min培养3 d。

1.4 粗酶液的制备

取5 mL 活化菌液转到装液量为80 mL 的供试产酶培养基中（250 mL），25 ℃、120 r/min 培养9 d。将培养好的产酶菌液用双层擦镜纸过滤，滤液在4 000 r/min 下离心10 min，上清液即为粗酶液。-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 漆酶活性测定

以ABTS为底物[8]（λ420 nm处ABTS的摩尔吸光系 数：3.6×104mol/cm），3 mL 反 应 混 合 液 中 含2.75 mL pH3.8 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，200 μL 0.5 mmol/LABTS 和50 μL 粗酶液，25 ℃反应2 min 后立即用冰浴终止反应，于420 nm 处测定吸光度。以灭活的酶液反应混合液为对照。酶活单位定义：1 min 内催化氧化1 mmol ABTS 的酶量为1个酶活单位[9]。

式 中：ε420（ABTS）=3.6×104 mol/cm；Δt—2 min；ΔOD—2 min 内吸光度OD 的变化值；V1—酶反应中反应液的总体积，3 mL；V2—酶反应中酶液的体积（mL）

1.6 碳源、氮源单因素试验

碳源的筛选：分别用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、麸皮代替基本产酶培养基中的碳源，配制成5 种不同碳源的产酶培养基，考察不同碳源下菌株的产酶量。

氮源的筛选：分别用7 种氮源代替基本产酶培养基中的蛋白胨，配制成7 种不同氮源的产酶培养基，考察不同氮源下菌株的产酶量。7 种氮源为：蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、酒石酸铵、蛋白胨+酵母粉、蛋白胨+硫酸铵、蛋白胨+酵母粉+硫酸铵。

1.7 P-B因素水平设计

根据单因素试验结果，选取蔗糖、蛋白胨+酵母粉、MgSO4、KH2PO4、CuSO4、VB16 个营养因素，采用11 因素12 个试验组的P-B 试验，因素水平设置如表1。

表1 P-B试验因素和水平

1.8 响应面优化设计

根据P-B 设计结果筛选出的3 个显著影响因素（蔗糖、MgSO4、KH2PO4），采用CCD 设计对闽金1 号产漆酶发酵条件进行3 因素5 水平的响应面分析。因素水平设置如表2。

表2 CCD设计因素和水平

2 结果与分析

2.1 碳源筛选结果

如图1 可见，以蔗糖和葡萄糖为碳源的培养基产漆酶活力较高，考虑经济原因，确定蔗糖为金针菇闽金1号产漆酶培养基的最佳碳源。

图1 碳源对供试菌株（闽金1号）漆酶产量的影响

2.2 氮源筛选结果

如图2可见，蛋白胨+酵母粉为氮源的培养基漆酶活力最高（682.22 μ/mL），其余6 种氮源培养基漆酶活力依次是蛋白胨＞酵母粉＞酒石酸铵＞蛋白胨+硫酸铵＞蛋白胨+酵母粉+硫酸铵＞硫酸铵。因此，确定蛋白胨+酵母粉为闽金1 号产漆酶培养基的最佳氮源。

图2 氮源对供试菌株（闽金1号）漆酶产量的影响

2.3 P-B试验结果

P-B 试验选取蔗糖、蛋白胨+酵母粉、MgSO4、KH2PO4、CuSO4、VB16 个营养因素，添加5 个虚拟因素进行全面考察，选用n=12 的P-B 设计，每个因素选高低2 个水平，以漆酶活性为响应值（Y），按表3设计进行试验。

表3 P-B试验设计

由表4 可知，各因素中蛋白胨+酵母粉、VB1对漆酶活性具有正效应，而蔗糖、MgSO4、KH2PO4、CuSO4为负效应。混合营养培养基组分中显著影响漆酶活性的因素依次为：KH2PO4、蔗糖、MgSO4，贡献率分别为38.36%、17.83%和15.89%。因此，选取KH2PO4、蔗糖和MgSO4作为显著因素，进一步优化。

表4 P-B设计结果及效应分析

2.4 响应面优化结果

结果见表5。模型的建立与方差分析以KH2PO4、蔗糖、MgSO4为自变量。通过Design-Ex‐pert 8.5软件对表5数据进行二次多项回归拟合获得编 码 的 回 归 方 程 为Y=920.10+7.4×A-64.03×B+21.19×C-24.06×A×B+23.65×A×C+35.52×B×C-38.82×A2-109.83×B2-4.94×C2。

表5 CCD实验设计及结果

回归模型的方差分析结果见表6，模型的F=5.92，P＜0.05，表明该模型显著。模型失拟项（lack of fit）表示模型预测值与实际值不拟合的概率，P＞0.05，失拟项不显著[10]，因此模型选择正确。模型中的参数B 和B2达显著水平，表明MgSO4体积质量对漆酶酶活性具有显著的线性效应和曲面效应。模型的相关系数R2=0.8420，表明方程拟合较好。综上所述，回归方程为闽金1 号营养培养基产漆酶预测分析提供了一个合适的模型。

表6 二次多项回归模型的方差分析

由图3 可以看出，随MgSO4体积质量的上升，漆酶活性呈现先上升后下降的趋势，而蔗糖对酶活性的影响相对较小。在等高线图中，沿MgSO4轴方向，等高线变化密集，而沿蔗糖轴方向，等高线的变化稀疏。故MgSO4对酶活性最大值的影响大于蔗糖，是影响酶活性的主要效应因子。图4 显示KH2PO4和蔗糖对酶活性的交互影响，从等高线图可以看出此二因素间的交互作用较显著，因为等高线的形状反映交互效应的强弱大小，椭圆形等高线表示二因素交互作用显著。当KH2PO4体积质量较高时，可获得较高的酶活性，随蔗糖体积质量的增加，酶活性呈现先高后低的变化趋势。图5表明在选定的试验水平范围内，较低体积质量的MgSO4可获得较高的酶活性，而KH2PO4的体积质量影响不大。从等高线图可见，MgSO4对酶活性的影响远大于KH2PO4，是主要的影响因素。

图3 MgSO4和蔗糖对供试菌株（闽金1号）漆酶产量的响应面图和等高线图

图4 KH2PO4和蔗糖对供试菌株（闽金1号）漆酶产量的响应面图和等高线图

图5 KH2PO4和MgSO4对供试菌株（闽金1号）漆酶产量的响应面图和等高线图

因此，KH2PO4与蔗糖对酶活性的交互影响显著，MgSO4与KH2PO4和蔗糖对酶活性的交互影响不显著。通过优化顶点分析，得到模型的3 个优化参数 分 别 为 蔗 糖22.27 g/L、MgSO40.96 g/L、KH2PO41.25 g/L，预测的最大漆酶活性为945.981 U/L。

3 小结

采用响应面优化法中的P-B 设计，从11 个营养因素中筛选出影响金针菇闽金1 号产酶的主要营养因素依次为蔗糖、MgSO4、KH2PO4。在此基础上，进一步采用CCD 设计建立了预测闽金1 号高产漆酶的模型，优化了主要参数的水平。通过中心组合试验，采用统计学的方法得出闽金1 号发酵产漆酶的二次多项数学模型，得到蔗糖、MgSO4、KH2PO4对漆酶活性最大值的影响大小依次为MgSO4＞蔗糖＞KH2PO4，所得优化混合培养基参数为蔗糖22.27 g/L、MgSO40.96 g/L、KH2PO41.25 g/L。模型预测的最大漆酶活性为945.981 U/L。此结果为今后金针菇闽金1 号菌株进一步开发利用提供科学依据。