微波消解−电感耦合等离子体质谱快速测定葡萄籽提取物微量元素的研究

方 岚 潘小红

（1.云南省食品药品审核查验中心，云南 昆明 650106；2.湖南省药品检验检测研究院，湖南 长沙 410001）

葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）是葡萄籽提取分离得到的原花青素等多酚类物质[1]，其生物活性的研究在国内外已非常广泛。研究表明，其具有清除自由基[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗菌[5]、抗疲劳[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、保护机体损伤[9]等药理作用，对阿尔茨海默病具有一定的防治作用[10]，广泛用于药品、食品及化妆品行业。葡萄籽花青素研究有大量文献报道[11−13]，但微量元素的分析鲜有研究。有研究表明，微量元素参与细胞代谢，与蛋白质结合形成酶、激素；微量元素与一些功效成分有关，决定了食品、药品、化妆品的安全性，在植物体本身所含微量元素之间的协同和拮抗有关[14−18]。

电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP−MS）作为近年元素分析的热点方法，具有线性范围宽、精密度高、检测速度快、可进行实时检测等特点，被广泛应用于中药、食品、化妆品等的痕量和超痕量分析。至今为止，尚未见采用ICP−MS 测定葡萄籽提取物中微量元素含量的相关报道。本研究采用高压微波消解，建立葡萄籽提取物微量元素ICP−MS 检测方法，并对葡萄籽中47 种微量元素进行测定，应用芹菜成分分析标准物质对该方法进行验证表明，此方法提高了葡萄籽微量元素测定的灵敏度、精密度及准确度。研究结果以期为葡萄籽提取物微量元素含量测定提供参考依据，同时为葡萄籽提取物的质量监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

葡萄（Vitis vinifera）种子样品共11 批，分别为湖南省保健食品加工厂种子（S1）、湖南省保健食品加工厂种子（S2）、汇生源生物科技种子（S3）、奥邦生物科技种子（S4）、鼎盛生物食品种子（S5）、贵研坊生物种子（S6）、石家庄健禾生物科技有限公司种子（S7），原料产地新疆；龙腾生物种子（S8），原料产地山西；浙江一诺生物科技种子（S9），原料产地山东；天津市尖峰生物科技种子（S10）、圣嘉德生物老店种子（S11），原料产地法国。

1.1.2 仪器设备

仪器设备：电感耦合等离子体质谱仪7700 Series（美国Agilent 公司），微波消解仪Mars5（美国CEM 公司），电子控温加热板BHW−09C（中国博通公司），A10 超纯水机Milli−Q（美国Millipore），电子天平XS204（瑞士Mettle Toledo）。

1.1.3 试剂及标准溶液

1）试剂：硝酸，购自德国Merck 公司，为优级纯。质谱调谐液，购自美国Agilent 公司，密度为 1 μg/L，元素种类为Ce、Co、Li、Mg、Y、Ti。

2）标准溶液：银、砷、钡、铍、铋、镉、钴、铬、铯、锂、铜、铟、锂、锰、镍、铅、铷、钪、锶、钛、钒、镧、铈、镨、铷、钐、铕、钆、铽、钬、铒、铥、镱、镥、钇标准溶液浓度为10 μg/L，来自国家有色金属及电子材料分析测试中心；钾、钙、镁、钠、硼、铝、铁、锌、锡、铯、钼、锑、汞、铑、铼标准溶液浓度均为1 000 μg/mL，来自国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器工作条件

为确保盾构管片受力对称，避免隧道轴线偏移，则需要在同环布置两个注浆孔，且两孔均匀对称注浆；隧道纵向采取间隔跳孔施工的原则，间隔环数不宜少于2环管片[12]，且为避免加固段与非加固段在后期产生过大的差异沉降，建议设置一定范围的过渡段。注浆孔位的布置详见隧道下卧层注浆加固横断面(见图5)和隧道下卧层注浆加固范围(见图6)。同时，每个注浆孔应通过分层、少量、多次的方式从隧道底部向下分层搭接叠加注浆，使隧道沉降在注浆抬升和注浆间隔时间内的固结沉降的交替作用下渐趋稳定，直至两次注浆间隔时间内的沉降量趋于零时，则停止注浆。

用质谱调谐液对ICP−MS 进行调谐，优化仪器工作参数，使仪器质量轴、灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等各项指标达到最佳。射频功率1 550 W，采样深度8.0 mm，镍（Ni）采样锥，同心雾化器，冷却气流量15.0 L/min，载气流速1.0 L/min，补偿气流量0.8 L/min，样品提升速率1.0 mI/min，蠕动泵采集转速0.1 r/min，蠕动泵30 s提升转速0.3 r/min，稳定40 s，样品测定3 次，B、Al、Se 元素为No gas 模式，其余元素为He模式。

1.2.2 样品溶液的制备

将葡萄籽破碎，以70%乙醇提取，浓缩，稀释，沉淀，经大孔吸附树脂吸附、洗脱、干燥，得到葡萄籽提取物。每种样品取0.50 g 于微波消解罐中，加入硝酸7 mL，轻轻摇动使样品散开，旋紧盖子，静置过夜，放于微波消解仪内。消解程序：室温至130 ℃，升温时间5 min，保持时间1 min；130～160 ℃，升温时间3 min，保持时间5 min；160～180 ℃，升温时间5 min，保持时间30 min，温度120 ℃条件下赶酸至蒸气挥尽，分次溶解并转移至25 mL 容量瓶中，定容至刻度。同法进行试剂空白的操作。

1.2.3 同位素及内标溶液的选择

在ICP−MS 分析中：一方面可以通过选择合适的同位素来尽可能地避免同质异位素和多原子离子的干扰；另一方面内标元素能有效地监控和校正分析信号的短期和长期漂移，并对基体效应具有明显的补偿作用[14−15]。本研究选用103Rh、185Re在线为内标，测量同位素，见表1。以内标元素克服基体效应和校正分析信号的飘移[19]，用2% HNO3溶液逐级稀释Rh、Re 至浓度为200 ng/mL 的混合内标溶液。

表1 测量同位素Table 1 Isotopes for measurement

1.2.4 标准曲线系列浓度的选择

本实验取多元素标准溶液（35 种）[20]及单元素标准溶液用2% HNO3溶液逐级稀释成一定浓度的中间溶液，其中Ca、Mg、Na、K 为160 μg/mL，Fe、Al 为40 μg/mL，Zn、Ti、B 为8 μg/mL，Hg 为0.016 μg/mL，其余元素为0.4 μg/mL。分别取上述中间溶液0.10、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 倒入50 mL 容量瓶中，用2% HNO3溶液稀释至要求刻度。标准曲线系列浓度：Ca、Mg、Na、K 为0.32、3.2、6.4、9.6、12.8、16.0 μg/mL，Fe、Al 为0.08、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μg/mL，Zn、Ti、B 为0.016、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μg/mL，Hg 为0.032、0.32、0.64、0.96、1.28、1.60 ng/mL，其余元素为0.8、8、16、24、32、40 ng/mL。重复3 次。

1.3 测定及分析方法

取参试样品按优化的仪器参数及处理方式，编制测定方法，在线引入内标103Rh、185Re，并观察其灵敏度，仪器稳定后，依次引入配制好的试剂空白、标准溶液、样品空白、样品溶液。根据待测同位素，应用校正方程计算葡萄籽提取物各元素的含量。选用芹菜（Apium graveolens）成分分析标准物质元素的测定值与参考值进行比较，并计算RSD 值，验证该方法对葡萄籽微量元素测定的灵敏度、精密度及准确度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线系列浓度的选择

ICP−MS 的干扰分为质谱干扰和非质谱干扰（基体效应），其中非质谱干扰−基体效应主要有空间电荷效应、信号的抑制或增强效应、由高含量总溶解固体引起的物理效应。非质谱干扰消除方法有稀释样品、内标法、标准加入法、去除基体等，质谱干扰主要有同量异位素重叠、多原子或加合物离子、难熔氧化物离子、双电荷离子。解决办法主要通过优化仪器条件参数，选择无干扰同位素（如78Se 代替80Se），应用干扰校正方程，冷等离子体技术，碰撞/反应池技术[21−23]。实验结果表明：Ca、Mg、Na、K 在0～16.0 μg/mL，Fe、Al 在0～4.0 μg/mL，Zn、Ti、B 在0～0.80 μg/mL，Hg 在0～1.60 ng/mL，其余元素在0～40 ng/mL范围内，方法的线性关系良好，47 种元素的相关系数为0.995 9～1.000 0，满足检测需求，结果见表3。

表3 元素标准曲线Table 3 The standard curve of elements

续表 3

2.2 精密度、回收率及准确性分析

葡萄籽提取物为植物性原料，为了验证本实验室建立的微波消解处理样品及电感耦合等离子体质谱的实验方法与步骤是否符合要求，所得数据是否准确可信。选用芹菜成分分析标准物质元素的测定值与参考值进行比较，并计算RSD 值，47种元素的精密度数值均在 0.1%～5.4%，回收率为82.7%～112.8%，符合《食品安全国家标准食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）[24]第一法ICP−MS 精密度的要求，见表4。

表4 精密度、空白回收率及准确性Table 4 The precision,accuracy and the recovery rate

续表 4

2.3 检出限的检测

检出限的高低能准确地反应仪器的性能。本研究用制备标准溶液的稀释液，2% 硝酸为空白溶液，连续11 次测量值的标准偏差的3 倍为检出限，大多数元素的检出限小于0.1 μg/L，见表5。

表5 47 种元素的检出限 Table 5 The LOD for 47 elements μg/L

2.4 葡萄籽提取物样品的测定

11 批葡萄籽提取物47 种元素的测定结果见表6。从测定结果可以看出：葡萄籽提取物中的元素含量较丰富；不同葡萄籽提取物中相同元素测定结果相差较大，但仍呈现相同的规律。钾、镁、钠、钙、铁元素含量高；铝、锰、镍、铜、硼、锌、铷、锶、锡、钡、钼元素相对较高；铅、砷、汞、镉、铬及15 种稀土元素含量较低；锂、铍、银元素极低，甚至未检出。

表6 样品测定结果Table 6 The determination results of samples

续表 6

3 结论与讨论

运用电感耦合等离子体质谱法进行微量元素测定时，植物样品的分解和有机溶剂的残留会影响测定结果。本研究采用微波消解进行前处理，操作简单，消解完全，处理耗时少，样品不容易被污染，可以避免样品分解和有机溶剂残留对实验的影响。因电感耦合等离子质谱法具有线性范围宽、准确性较高、灵敏度较高、可同时进行多元素快速分析的特点，目前已在中药、食品、化妆品领域广泛运用[21−25]。

本研究采用微波消解−电感耦合等离子体质谱法测定葡萄籽提取物所含的钾、镁、钠、钙、铁等 47 种元素的方法。通过对测定方法、同位素和内标溶液的选择精密度、回收率及准确度等实验，建立了葡萄籽提取物中47 种微量元素ICP−MS 方法。采用硝酸溶液加入测试样品进行微波消解后,以103Rh、185Re 作为内标,47 种元素的相关系数为0.995 9～1.000,方法检出限为0.001 1～0.087 μg/L,加标回收率为82.7%～112.8%。运用本方法对葡萄籽提取物多种元素的含量同时进行检测,具有快速、稳定、准确度高、精密性好等优势。有文献[26]报道采用ICP−AES 方法测定葡萄籽提取物中的18 种元素含量，检出限为0.009～0.081；本研究选用ICP−MS 法测定元素，检出限低，线性范围宽，可以为葡萄籽提取物的质量控制、安全性评价提供基础研究。

从11 批葡萄籽提取物47 种元素的测定结果看，葡萄籽提取物的元素含量较丰富，不同葡萄籽提取物中相同元素测定结果相差较大，但仍呈现相同的规律。有益元素钾、镁、钠、钙、铁元素含量高；有害元素铅、砷、汞、镉、铬及15 种稀土元素含量较低；锂、铍、银元素极低，甚至未检出。但本实验不足的是葡萄籽提取物样品主要为网络少量购买，产品基本为散装，信息不全，缺少批号、提取工艺、提取原料、产品品种、部分厂家等信息，推测这也是不同葡萄籽提取物相同元素测定结果相差很远的一个原因。在今后的研究中，以期收集更多不同产地的葡萄籽提取物，测定与葡萄品种、属地、提取工艺结合研究，积累更多数据。进一步探讨植物体内金属元素的含量差异是否与其被临床研究证明的作用有关，是协同作用或是拮抗作用，还有待进一步研究。植物体各种元素的主要来源是土壤，其含量与环境中的元素含量有一定的相关性[27]，可以通过对不同产地的地理标志农产品所具有的元素种类和含量进行检测分析，为产地溯源提供技术支撑。