多重耐药鲍曼不动杆菌生物被膜形成能力在医院感染监测中的研究

李凯旋，狄友华，周 杨，王 幸，陈 蕾，严蕊娜

（1.西安医学院第二附属医院控感科，陕西西安，710038；2.西安医学院第二附属医院呼吸与危重症医学科，陕西西安，710038）

鲍曼不动杆菌（AB）非发酵革兰阴性杆菌，专性需氧，属于不动杆菌属。通过环境、各类医疗器械表面以及医务人员的手传播，对温度和pH有较强的适应能力，在干燥环境和非生物表面均可长期存活。是近年来医院获得性感染的重要条件致病菌之一［1］。最常发生于重症监护室（ICU）的有严重基础疾病、气管切开/插管、高龄且住院时间长、免疫功能低下或缺失、接受呼吸机或中心静脉置管等侵入性操作患者，可引起呼吸机相关性肺炎（VAP）、血流感染（败血症）、手术伤口感染、软组织感染、泌尿生殖道感染、中枢神经系统感染（脑膜炎）等难治性感染甚至死亡［2］。据全球相关报道统计每年感染鲍曼不动杆菌约有100万人，多重耐药菌株引起感染占其中一半数量［3］，在鲍曼不动杆菌感染者中ICU患者的死亡率达45%～60%，若被泛耐药鲍曼不动杆菌感染可达到84.3%［4-5］，给临床治疗带来了极大的困扰和挑战，引起临床医生以及微生物研究者的高度关注。

生物膜的形成是细菌的主要耐药机制之一。形成生物膜的菌株耐药性可以提高10～1000倍。据估计，65%～80%的人类感染是由具有生物膜形成能力的细菌引起［6］。当鲍曼不动杆菌形成生物被膜后，使机体的吞噬细胞和杀伤细胞不能对细菌产生有效攻击，同时抗生素亦不能有效清除生物膜，还可诱导耐药性产生；同时被生物膜包裹的细菌难以获得氧气和营养，处于休眠状态，从而对抗生素不敏感，待抗生素治疗停止后残存细菌迅速繁殖，使用抗菌药物不能完全对其彻底清除，导致被感染对象反复发作，难以治愈。鲍曼不动杆菌的强耐药性与生物膜的形成有一定的相关性。本文旨在检测临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株的生物膜形成能力，统计分析生物膜阳性多耐菌的分布，并为临床治疗提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源：收集医院2018年3月—2020年3月临床住院患者痰液、分泌物、肺泡灌洗液、尿液、血液等标本分离培养出的多重耐药鲍曼不动杆菌89珠，经VITEK-2全自动细菌鉴定仪鉴定符合本实验菌株要求。剔除同一患者相同部位重复菌株。鲍曼不动杆菌质控菌珠ATCC19606购于北京三踏生物科技有限公司。

1.1.2 试剂和耗材：普通琼脂粉、营养肉汤培养基、结晶紫染液、刚果红培养基（上海裕明实业有限公司），PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司），96孔细胞培养板（赛业生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器：比浊仪（山东鑫科生物科技股份有限公司），生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司），分析天平（MT仪器上海有限公司），多功能酶标仪（美国宝特有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 刚果红琼脂培养基的配制：用分析天平精确称取刚果红干粉0.8 g、脑心浸液干粉37 g、葡萄糖50 g、琼脂粉150 g，加入无菌蒸馏水至1000 mL，充分摇匀后分装于两个锥形瓶中，橡胶塞封口，121℃高压蒸汽灭菌15～20 min，当温度降至55℃时，在生物安全柜中倒入直径为9 mm的培养皿，静置4℃冰箱冷藏备用。

1.2.2 刚果红琼脂培养基定性初筛：将筛选出的实验多耐菌株分别接种于刚果红培养基中，生化培养箱35℃恒温培养18～24 h，然室温放置24 h，观察结果：呈黑色、干燥粗糙、出现结晶的菌落为生物膜阳性菌株，而红色光滑菌落则为不产生生物膜菌株。

1.2.3 菌悬液的配制：将刚果红培养基上显示为生物被膜阳性菌株直接接种于血琼脂平板上，经过37℃、100 rpm振摇培养18～24 h至对数期，3000 rpm离心5 min，弃上清，再用无菌生理盐水调节菌液浊度至0.5麦氏浊度（1.5×108CFU/mL）。

1.2.4 生物膜形成的定性测定：在6孔细胞培养板上建立多重耐药鲍曼不动杆菌生物膜，以质控菌株作为对照组。挑取质控菌株和实验菌株于5ml LB肉汤培养液中，37 ℃恒温培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，用比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浊度，6孔细胞培养板内加入26 mm×21 mm已灭菌的盖玻片，分别吸取2 mlLB肉汤培养液和200 μl菌液加入6孔细胞板中，37℃恒温生化箱培养，每24 h更换培养液1次，3天后将盖玻片从培养基中移出，用无菌PBS溶液快速冲洗3次，以去除盖玻片上附着的浮游菌，室温静置风干后，在酒精灯上加热固定，然后用1%结晶紫溶液染色20 min，再用无菌PPS溶液快速冲洗3次，以便除去多余的染液，室温静置风干。置于2.5%戊二醛中浸泡固定，于4℃冰箱保存，次日再用无菌PBS溶液冲洗3次，室温静置风干用于扫描电镜观察。

1.2.5 生物膜形成的定量测定：在96孔细胞培养板内各加入100 μl菌液和100 μlLB培养液，每24 h更换LB培养液1次，以未加菌液的LB培养液作为空白对照，恒温培养3 d后用PBS溶液冲洗细胞培养板，室温静置风干后，加入1%结晶紫溶液200 μl室温染色20 min，用无菌PBS溶液冲洗染液，室温静置风干后，再加入95%乙醇脱色15 min，以便洗去多余的结晶紫，将多功能酶标仪调节至570nm波长处，然后测定其吸光度（A）值。生物膜形成阳性以均值为空白对照2倍以上为判定标准［7］。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0软件，计数资料以百分率（%）表示，单因素方差分析组间实验数据，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

89株多耐药实验菌株分别接种在刚果红培养基中，培养3 d后有64株呈阳性反应，产生黑色干燥菌落，为产生物膜的菌株，阳性率达71.91%（64/89）。回顾标本来源生物膜阳性的多重耐药鲍曼不动杆菌以呼吸与危重症医学科的ICU病房最多，占45.31%（29/64），重症医学科占21.88%（14/64），神经外科17.19%（11/64），普外科和骨科均为10.94%（7/64），其他科室9.38%（6/64）。

将筛选出的产生物膜多重耐药实验菌株在6孔细胞培养板上培养3 d后均可以形成成熟的生物膜，经结晶紫染色后肉眼可见盖玻片表面覆盖有一层紫色致密物质，将盖玻片放置于高倍镜下观察，清晰可见大量细菌相互黏连包裹于其中，形成膜状微菌落（图1），经革兰染色的浮游性鲍曼不动杆菌在高倍镜下观察，细菌呈分散方式分布（图2）。扫描电镜观察实验菌株和质控菌株图像，发现实验菌株细菌黏连聚集包裹融合成立体膜状集落结构，而质控菌株则是大量细菌聚集成团形成分散的微菌落，由此可见实验菌株形成生物膜的能力较标准菌株更强一些（图3和图4）。

图1 体外培养形成的生物膜（×40）

图2 浮游型鲍曼不动杆菌（×40）

图3 质控菌株生物膜（×5000）

图4 实验菌株生物膜（×5000）

89株多耐实验菌株在96孔细胞培养板培养3天后，经多功能酶标仪测定其吸光度值发现，培养48 h形成的生物膜量最高，结果显示：71珠多重耐药鲍曼不动杆菌能够形成生物膜，阳性率达79.78%（71/89），刚果红培养基中呈阳性反应的菌株在细胞培养板上均能形成细菌生物膜。行单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

图5 多功能酶标仪测定结果

3 讨论

生物膜细菌是细菌的另一种生存方式，由外界多种因素影响和细菌自身相互作用产生，生物膜的形成延长鲍曼不动杆菌在医院环境中的存活时间，使菌株定值于医院环境设施（如床栏、门把手）、医护人员手、气管导管、中心静脉置管等，逃避宿主免疫系统的免疫杀伤作用，极大增强了对抗生素的耐药性，是院内感染广泛传播的主要原因，进一步加重鲍曼不动杆菌感染者的病情和治疗难度，因此，强化环境物表的清洁消毒，增加消毒频次，定期监测消毒效果，减少致病菌的定植传播，严格执行无菌操作，及时评估留置管道感染风险，今早拔除各类管道，减少耐药菌株的产生，提高医务人员手卫生意识，阻断传播途径，严格落实多重耐药菌管理预防和控制措施。

本研究通过刚果红培养基定性法和结晶紫染色定量法分别对临床分离的89珠多重耐药鲍曼不动杆菌进行生物膜形成能力的检测，其中70%以上多重耐药鲍曼不动杆菌均能形成生物被膜；刚果红培养基中呈阳性反应的菌株经结晶紫染色培养、扫描电镜观察实验菌株细菌黏连聚集包裹融合成立体膜状集落结构；71株多重耐药鲍曼不动杆菌在96孔细胞培养板上均能形成细菌生物膜，且在48 h时生物膜量达到峰值。表明临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌大多都已形成细菌生物膜，与 Zeighami等［8］研究结果一致。杨芬等［9］对临床152株鲍曼不动杆菌进行生物膜形成能力检测，其生物膜阳性率达89.5%。文献报道的临床鲍曼不动杆菌生物膜阳性率虽然存在一定差异，但大多实验结论表明其具有较高水平的形成能力，这可能与标本地域、来源科室、标本部位及类型、培养基成分、实验检验方法等导致不同研究结果差异。

目前研究确定的生物膜耐药机制主要有以下几个方面：①生物膜的限制渗透作用，成熟稳定期的生物膜是由大量胞外基质及高密度细菌形成致密空间结构，限制抗菌素的渗透，减缓抗菌素的扩散速度，降低抗菌素的有效浓度，使其不能发挥杀菌作用。②生物膜的营养限制学说，生物膜内的营养物质由外及内是逐级递减的，深层细菌处于饥饿状态不受抗菌素的干预，在治疗停止后，残存的细菌又迅速繁殖，形成耐药性更强的生物膜，从而使感染迁延不愈［10］。③外排泵基因、耐药性相关基因和生成基因等多种基因表达上调，且部分基因仅在生物膜状态下表达。④QS感应系统，承担细菌相互传递信号的作用，通过调控生物膜的形成和外排泵作用来增加耐药性。⑤免疫逃逸，细菌被包裹在胞外基质内，免疫吞噬细胞和杀伤细胞不能对细菌产生有效攻击，从而使感染反复，迁延难愈。

生物膜状态下的鲍曼不动杆菌其耐药性不仅包括细菌本身的耐药机制，同时还具备生物被膜的耐药机制，使感染更难治愈。目前国内外学者主要从抗细菌黏附、清除已形成的生物膜、干预生物膜形成、新型抗菌素的研发以及中西药结合等方面寻找防控和治疗生物膜感染性疾病的方法。杨佩红等报道替加环素对MDR-Ab具有较好的抗菌活性，且可以破坏结构稳定的生物膜［11］。天蚕素A、SET-M33脯氨酸二聚体A3-APO等抗菌肽可破坏鲍曼不动杆菌生物膜［12］。中药五倍子能抑制鲍曼不动杆菌的生长及其生物膜的形成［13］。噬菌体能破坏已形成的生物膜，主要机制包括编码裂解酶、破坏QS系统、裂解宿主菌［14］。赖必鹏等［15］报道DnaJ基因过表达能显著抑制鲍曼不动杆菌生物膜形成能力。ICU分离出的鲍曼不动杆菌均为多重耐药菌株，多黏菌素B可通过减少细菌胞外分泌物含量来影响其生物膜形成能力，从而达到杀菌效果［16］。在临床体外试验中多重耐药的鲍曼不动杆菌具有很强的耐药性且与生物膜形成能力呈正相关。生物被膜的产生是其多重耐药机制的重要原因之一，病原菌被膜包裹增加了临床控制感染的难度，其传播途径主要为接触传播，因此做好院内感染的防控工作及其重要。虽然对多重耐药鲍曼不动杆菌生物膜的形成和耐药机制有一定认识，但其耐药机制复杂，部分研究结果仍存在分歧，有待进一步深入研究，因此临床应以预防为主，落实各项防控措施，防止生物膜形成，合理使用抗菌药物，结合多种方法治疗鲍曼不动杆菌的感染。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。