三七原料药材与注射用血栓通(冻干)中皂苷类成分对比分析及转移规律研究

张智勇，王 龙，冯绘敏，胡云飞，李 正，李文龙,3

(1.天津中医药大学中药制药工程学院，天津 301617；2.省部共建组分中药国家重点实验室，天津 301617；3.北京大学药学院，北京 100191)

三七是五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎，是我国传统中药材，味甘、微苦、温，归肝、胃经，具有散瘀消肿、消肿止痛之功效，常用于吐血、咯血、便血、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等病症[1]。研究发现[2-4]，三七具有抑制动脉血栓和血小板活化的作用，可通过抗炎和抗氧化途径保护心血管系统，减少脑损伤诱导的神经元凋亡，从而治疗缺氧缺血性脑病。三七中皂苷类成分是其发挥临床药效的基础，也是质量控制的指标[5]。迄今为止，从三七原料药材的不同部位共分离出70多种皂苷成分，主要为达玛烷型的20(S)-原人参二醇(20(S)-protopanaxadiol)和20(S)-原人参三醇(20(S)-protopanaxatriol)[6]。几种主要的皂苷类成分结构式示于图1。

图1 三七中主要皂苷类成分的化学结构Fig.1 Chemical structures of main saponins from Panax notoginseng

目前，我国以三七为原料制成的注射剂品种较多，如血塞通注射液、血栓通注射液、血栓通粉针剂等，这些制剂均具有活血祛瘀、扩张血管、促进血液循环的功效，临床上常用于心脑血管类疾病的治疗[7]，但三七总皂苷的成分、含量以及不同皂苷所占的比例各不相同。其中，注射用血栓通(冻干)于1993年正式生产,2002年收载入《国家中成药标准汇编》经络肢体脑系分册，是一种治疗缺血性疾病的中药处方[8-11]。赵一懿等[12]采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)法全面比较血塞通、血栓通注射液中化学成分的差异，发现三七总皂苷对照提取物及血栓通注射液中极性小的成分较少，而血塞通注射液中极性小的成分较多，可能是由于选取三七的部位不同，或者各厂家提取总皂苷工艺不同所致。血塞通注射液制剂过程受原料药材、三七总皂苷提取[13-15]、过滤[16-17]、纯化工艺[18-19]等诸多因素影响。李钊文等[20]考察了三七总皂苷提取液的层析浓缩方法，提高了三七总皂苷的快速浓缩富集能力；耿魁魁等[21]采用正交试验法优选注射用血塞通调配工艺，并对人参皂苷R1在不同溶媒中的稳定性进行考察；熊海伟等[22]通过观察三七总皂苷超滤前后的瞬时浓度变化，研究不同孔径的滤膜对三七总皂苷动态透过率的影响，发现超滤过程中，人参皂苷Rb1和Rd损失较大，而药液温度和滤膜孔径对三七中活性成分的动态透过率有显著影响；张琳等[23]通过Box-Behnken响应面法优选大孔树脂分离纯化三七总皂苷的工艺条件及参数，通过静态吸附法优选大孔树脂型号，发现D101型大孔树脂吸附效果最好。

HPLC法和HPLC-Q-TOF MS法可用于快速鉴定和分析含有三七皂苷和人参皂苷类成分的化合物。Wu等[24]采用UPLC-MS/MS法同时测定了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re及其皂甙元；Liu等[25]采用UPLC-Q-TOF MS法测定三七中主要皂苷类成分，并对其指纹图谱进行分析和鉴定，为三七总皂苷的真伪鉴别提供了一种快速的质量评价方法；赵静等[26]采用UPLC-Q-TOF MS法快速鉴定三七中17种化合物，包括4对人参皂苷同分异构体，并探讨其裂解规律及特征离子。

本实验拟采用HPLC法对三七原料药材提取液和注射用血栓通(冻干)进行定性分析，根据出峰时间鉴定主要色谱峰，采用HPLC-Q-TOF MS法对比分析三七原料药材提取液和注射用血栓通(冻干)中活性成分，阐明三七原料药材到注射用血栓通(冻干)过程皂苷类成分的转移规律，旨为进一步的工艺优化及工艺评价提供参考依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity高效液相色谱分析系统：美国Waters公司产品；5600 Q-TOF MS高分辨质谱仪：美国AB Sciex公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)，SCIEX OX数据软件处理系统。

三七原料药材及血栓通注射液：由广西梧州制药(集团)股份有限公司提供，二者为对应关系；三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rd、Re、F2以及七叶胆苷ⅩⅦ：纯度≥95%，上海源叶生物公司产品；乙腈(色谱纯)、甲酸(质谱纯)：美国Fisher公司产品。

1.2 三七提取物的制备

称取一定量的三七原料药材，用10倍70%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压真空浓缩，干燥，密封保存，备用。

1.3 对照品溶液的制备

分别精密称取2 mg三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rd、Re、F2，七叶胆苷ⅩⅦ对照品粉末于10 mL容量瓶中，甲醇溶解至刻度，摇匀，稀释100倍，过0.45 μm微孔滤膜，即得对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备

精密称取0.50 g三七提取物冻干粉，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超声20 min，放冷，甲醇定容，摇匀，稀释100倍，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

精密称取适量的注射用血栓通(冻干)，用甲醇稀释成约含5 mg/L总皂苷的溶液，即得供试品溶液。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；柱温40 ℃；流动相为0.01%甲酸-水(A)-0.01%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～6 min(82%A)，6～12 min(82%～79%A)，12～14 min(79%～70%A)，14～21 min(70%～55%A)，21～35 min(55%～25%A)，35～40 min(25%～20%A)，40～45 min(20%～10%A)；流速0.35 mL/min；进样量5 μL。

1.5.2质谱条件 ESI离子源，负离子模式采集数据，喷雾电压4.5 kV，离子源温度500 ℃，碰撞能量35 eV，质量扫描范围m/z50～1 500。

2 结果与分析

2.1 三七皂苷成分HPLC特征图谱

8个参考化合物的混合溶液、三七原料药材提取液以及注射用血栓通(冻干)的HPLC特征图谱示于图2。混合标准品溶液中，8种常见的参考化合物在高效液相色谱中实现基线分离；相较于三七原料药材提取液，注射用血栓通(冻干)的色谱图中化学成分较少，保留时间25 min后，三七原料药材提取液的谱图仍显示有少量的色谱峰信号，但注射用血栓通(冻干)中几乎没有出现色谱峰信号。总之，HPLC法对三七原料药材中皂苷类成分的分析具有快速、分离效能高、结果准确可靠、重现性好等优势，可广泛应用于三七原料药材提取物及其制剂的研究。然而，三七原料药材中皂苷类成分种类繁多，例如，谱图中人参皂苷Rb1附近的色谱峰十分丰富；此外，由于三七原料药材中七叶胆苷ⅩⅦ、人参皂苷Rg3、三七皂苷R2和人参皂苷F3等化合物的化学结构式相似，在HPLC色谱图中峰面积很小，难以鉴别。故通过对质谱碎片离子进行解析，进一步鉴别三七中主要皂苷类成分。

注：a.混合标准品溶液；b.三七原料药材提取液；c.注射用血栓通(冻干)图2 三七皂苷类成分的特征HPLC色谱图Fig.2 Characteristic chromatograms of saponins in Panax notoginseng by HPLC

2.2 负离子模式下的总离子流图

8种三七皂苷类成分混合标准品溶液的总离子流图示于图3a。在ESI-模式下，8种对照品得到了完全分离。三七原料药材提取液与注射用血栓通(冻干)的总离子流图分别示于图3b、3c。可以观察到，峰信号主要集中在25 min前，表明三七原料药材提取物和注射用血栓通(冻干)中主要为强极性和中等极性物质，弱极性物质较少。

2.3 各化合物的一、二级质谱图

在1.5节条件下，得到混合标准品溶液的一、二级质谱信息，分子质量信息与理论值吻合，各化合物的母离子及碎片数据列于表1。结果表明，三七皂苷类成分仅发生皂苷上糖键的断裂，并没有苷元的进一步裂解，这是因为苷元的四元环结构稳定，难以破坏。各化合物的一级质谱均出现[M+HCOO]-和[M-H]-离子。例如，三七皂苷R1的一级质谱碎片信息为[M+HCOO]-m/z997和[M-H]-m/z931，在二级质谱图中观察到m/z769[M-H-Glc]-、m/z637[M-H-C5H10O5-Glc]-以及m/z475[M-H-C5H10O5-Glc-Glc]-等碎片离子，示于图4；人参皂苷Rb1的相对分子质量为1 108，一级质谱碎片信息中可观察到m/z1 107[M-H]-、m/z1 153[M+HCOO]-等碎片离子峰，在二级质谱图中发现，该分子离子峰相继失去4个葡萄糖分子后，分别得到m/z945、783、621、459的碎片离子峰，其碎片离子信息示于图5。人参皂苷Rg1，Re，Rg2，Rd，F2以及七叶胆苷ⅩⅦ的质谱图示于图6。

注：a.对照品；b.三七原料药材提取液；c.注射用血栓通(冻干)图3 三七皂苷类成分的总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatograms of saponins in Panax notoginseng

表1 各化合物的母离子及主要碎片离子Table 1 Parent ions and major fragment ions of components

图4 负离子模式下，三七皂苷R1的一级(a)、二级(b)质谱图和可能的裂解途径(c)Fig.4 MS (a),MS/MS (b) spectra and proposed fragmentation pathways (c)of notoginsenoside R1 in negative ion mode

图5 负离子模式下，人参皂苷Rb1的一级(a)、二级(b)质谱图和可能的裂解途径(c)Fig.5 MS (a),MS/MS (b) spectra and proposed fragmentation pathways (c) of ginsenosides Rb1 in negative ion mode

图6 负离子模式下，人参皂苷Re(a)、Rg2(b)、Rb1(c)、Rd(d)、F2(e)以及七叶胆苷ⅩⅦ(f)的一级质谱图Fig.6 MS spectra of ginsenosides Re (a),ginsenosides Rg2 (b),ginsenosides Rb1 (c),ginsenosides Rd (d),ginsenosides F2 (e) and gypenoside ⅩⅦ (f) in negative ion mode

2.4 注射用血栓通(冻干)中皂苷类成分研究

通过观察负离子模式下注射用血栓通(冻干)与三七原料药材提取液的一、二级质谱图可知，一级电离出现[M+HCOO]-和[M-H]-等主要质谱信号峰，而二级电离出现糖基的断裂，可观察到皂苷苷元的碎片峰信号。通过与8种对照品溶液以及三七原料药材提取液的总离子流图进行对比，可以发现，几种主要皂苷类成分在注射用血栓通(冻干)中均可检测到。此外，由于三七中皂苷类成分存在较多同分异构体，其相对分子质量相同，结构相似，如人参皂苷Rg2与人参皂苷F2的相对分子质量均为783 u，人参皂苷Re、Rd以及七叶胆苷ⅩⅦ的相对分子质量均为945 u，这些化合物仅通过质谱信息难以鉴别，需要用对照品保留时间对比鉴别。

在三七原料药材提取液以及注射用血栓通(冻干)的一、二级质谱中，发现2个m/z783的分子离子峰。通过对比对照品的保留时间，确定出峰时间15.81 min为人参皂苷Rg2，推测另一个为人参皂苷Rg3。此外，分别在出峰时间15.37、13.69 min观察到m/z769的分子离子峰，推测为三七皂苷R2和人参皂苷F3，但出峰顺序存疑。

通过对比三七原料药材提取物与注射用血栓通(冻干)中总皂苷成分的峰面积，发现三七皂苷R1，人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Rb1、Rd、F2以及七叶胆苷ⅩⅦ的峰面积比值分别为2.55、6.88、3.02、9.75、31.30、15.68、15.98、714.34。其中，七叶胆苷ⅩⅦ的转移率最低，仅为0.14%，而三七皂苷R1的转移率最高，为39.22%。根据相关研究和实际生产经验，推测与制剂过程中大孔树脂的填料有关，在后续的工艺优化过程中，需要重视注射用血栓通(冻干)柱层析纯化过程中所用大孔树脂填料的比较和优选。

3 结论

本研究采用HPLC以及HPLC-Q-TOF MS法对三七原料药材提取液和注射用血栓通(冻干)中化学成分进行表征，初步探讨了由三七原料药材到血栓通制剂过程中总皂苷的转移规律，有助于增强对注射用血栓通(冻干)生产过程的理解，后续准备对三七总皂苷的提取工艺和不同填料的大孔树脂进行考察，优化血栓通注射剂生产过程中的各项工艺参数，为提升生产过程的可控性提供参考。