在线提取瓜子壳电喷雾技术在复杂基质样品检测中的应用

韩印森，吕 博，许庆轩,2,3，刘淑莹，周 芹,2,3

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2.农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，黑龙江 哈尔滨 150080；3.农业农村部糖料产品质量安全风险评估实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；4.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；5.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130021)

对于复杂基质样品的分析通常需要先进行复杂的样品前处理，再进行色谱分离，最后用质谱检测，1个样品的前处理过程和色谱分离需要数小时的时间，而质谱检测仅需要几秒钟。前处理过程和色谱分离是导致检测效率低的原因。

基于电喷雾离子源的原位分析技术有探针喷雾(probe electrospray ionization,PESI)[1]、木尖喷雾(wooden tips spray)[2]、叶喷雾(leaf spray)[3]、组织喷雾(tissue spray)[4]、直接电离(direct ionization)[5]等。探针喷雾和木尖喷雾的技术相似，都是将探针作为喷雾装置，样品附在针尖上加电压产生喷雾，区别是使用的材料不同，分别采用金属和木质材料作为探针。叶喷雾、组织喷雾和直接电离技术是将样品制作成尖端，加溶剂产生喷雾，样品作为喷雾基体，不再使用额外的装置。以上技术将质谱由封闭式检测转为开放式检测，在常压下即可运行，不需要样品前处理和色谱分离，可直接分析实际样品[6-8]，是目前最受欢迎的质谱技术之一。基于敞开式电离质谱，本课题组[9]开发了以瓜子壳作为电喷雾木质材料的新型电离源，具有如下优点：将提取与检测在线结合，缩短了分析时间，提高了分析效率；样品承载量大，能够将样品内部的成分提取出来，检测信号强，信号持续时间长；样品的适用范围广，可分析奶粉、土壤等粉末状样品。

本研究拟采用在线提取瓜子壳电喷雾技术，以瓜子壳作为提取和喷雾装置，通过分析几种复杂的基质样品，并与现有技术对比，评估其在复杂基质样品分析中的性能。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

离子源：实验室自制，其原理、装置示于图1[9]。

图1 在线提取电喷雾装置图Fig.1 Online-extraction of sunflower seed husk electrospray ionization mass spectrometry

将铜片固定在质谱仪入口附近，将处理好的瓜子壳削尖置于铜片上，通过电夹将高压施加在铜片上，控制瓜子壳尖端与质谱仪入口的距离为3 mm左右。

LCQ Fleet 离子阱质谱仪(配有Xcaliber工作站)、移液器：美国赛默飞世尔公司产品；Milli-Q超纯水机：美国 Millipore公司产品；电子天平：日本岛津公司产品；KQ-250DB 型超声清洗器：昆山市超声仪器公司产品；流动注射泵：美国KD Scientific公司产品；铜片、可调节高压直流电夹、生瓜子：均购自本地市场。

1.2 主要材料与试剂

甲醇：天津富宇精细化工公司产品；莠去津标准品(纯度≥99%)：德国Dr Ehrenstorfer公司产品；奶粉：大庆乳品厂产品；三聚氰胺(分析纯)：天津科密欧化学试剂公司产品；发芽的马铃薯：购自本地市场；土壤：取自本地。

1.3 实验条件

1.3.1样品处理 将莠去津标准品用甲醇溶解，配制成100 mg/L标准溶液，并进一步稀释至0.01 mg/L，备用。取1 g土壤，倒入10 mL莠去津标准溶液，搅拌均匀，配制成含0.01 mg/kg莠去津的土壤样品；另取10 mL甲醇倒入土壤中作为空白对照，晾干至粉末状。

用甲醇稀释三聚氰胺标准品，配制成100 mg/L标准溶液，并进一步稀释至0.001 mg/L，备用。取1 g奶粉，倒入10 mL三聚氰胺标准溶液，配制成含0.01 mg/kg三聚氰胺的奶粉样品；另取10 mL甲醇倒入奶粉中作为空白对照，晾干至粉末状。

在发芽的马铃薯上取0.01 g马铃薯芽，以马铃薯芽为中心，分别在距其0.5、1、1.5 cm处刮取0.01 g马铃薯皮和马铃薯块茎，用手术刀将其压碎，备用。

1.3.2质谱条件 正离子模式；全扫描方式；质量扫描范围m/z50～1 000；瓜子壳尖端角度控制在60°～90°范围内，瓜子壳尖端与质谱仪入口之间的距离为2～3 mm；喷雾电压设置在3.5～4.5 kV范围内；离子传输毛细管温度根据样品而定；关闭所有去溶剂化气体。

2 结果与讨论

2.1 奶粉中三聚氰胺分析

2008年，“三鹿三聚氰胺事件”引起了人们对婴幼儿奶粉安全性的广泛关注，采用的检测方法有液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等[10-11]，这些方法都需要复杂的样品前处理过程，费时费力。奶粉易溶于水、难溶于甲醇，而三聚氰胺易溶于甲醇、难溶于水，奶粉遇水后形成蛋白质溶液，被高压电离后会造成离子传输管堵塞。因此，向奶粉中加入甲醇将三聚氰胺提取出来，可避免形成蛋白质溶液。三聚氰胺的化学结构式示于图2。

图2 三聚氰胺化学结构式Fig.2 Chemical structure of melamine

本实验分别称取0.01 g空白样品和含0.01 mg/kg三聚氰胺的样品，依次放入瓜子壳中，向每份样品注射0.2 mL甲醇提取三聚氰胺，得到相应的质谱图。三聚氰胺呈碱性，在正离子模式下容易质子化形成[M+H]+分子离子，获得m/z127信号峰。空白奶粉质谱图示于图3a，未观察到m/z127信号峰，表明奶粉中的成分对三聚氰胺的检测没有影响；含0.01 mg/kg三聚氰胺奶粉的质谱图示于图3b，可观察到明显的m/z127信号峰，背景峰没有干扰。根据《食品安全法》及其实施条例规定：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg。本方法的检测限低于0.01 mg/kg，能够满足国家标准规定。与传统方法相比，该方法对每个样品的检测时间不超过1 min，可用于奶粉中三聚氰胺的快速检测。

图3 空白奶粉(a)和含0.01 mg/kg三聚氰胺奶粉(b)的在线提取瓜子壳电喷雾质谱图Fig.3 Mass spectra of blank milk powder (a) and milk powder spiked with 0.01 mg/kg melamine (b) using OE-SSH-ESI-MS

2.2 土壤中莠去津分析

土壤基质十分复杂，在溶液中形成胶体，对除草剂成分有强烈的吸附作用，前处理十分困难[12]，并且土壤样品数量庞大，使用传统方法费时费力，很难满足检测需要，寻找快速检测方法是解决这些问题的关键。

莠去津，又称阿特拉津，是一种三嗪类除草剂，其结构式示于图4。本实验分别称取0.01 g空白样品和含0.1、0.01 mg/kg的莠去津样品，依次放入瓜子壳中，向每份样品注射0.2 mL甲醇提取莠去津，得到相应的质谱图。在空白土壤中，未观察到m/z216离子，说明土壤中杂质成分对目标化合物的检测没有影响，示于图5a；含0.1 mg/kg莠去津土壤样品的质谱图示于图5b，可观察到明显的莠去津质谱峰m/z216；即使莠去津含量低至0.01 mg/kg，本方法也能检测出来，示于图5c，其余峰均为背景峰。

图4 莠去津化学结构式Fig.4 Chemical structure of atrazine

图5 空白土壤(a)、含0.1 mg/kg(b)、0.01 mg/kg(c)莠去津土壤的在线提取瓜子壳电喷雾质谱图Fig.5 Mass spectra of blank soil (a) and soil spiked with 0.1 mg/kg (b),0.01 mg/kg (c) atrazine using OE-SSH-ESI-MS

本方法无需前处理，1 min内即可得出结果，不仅操作简便，即使目标化合物含量低至0.01 mg/kg也能被检测出来。这是由于在高电场中瓜子壳实质是一个“电泳池”，带有不同电荷的物质向相反方向移动，使目标化合物从土壤中解吸附，被溶剂快速提取出来，得到了较高的灵敏度。

2.3 马铃薯中生物碱分析

α-卡茄碱是马铃薯发芽、变绿、溃烂后产生的一种有毒物质，人体摄入0.2～0.4 g即可引起中毒，过量摄入可致命，其结构示于图6。每100 g鲜重马铃薯中的茄碱含量，嫩芽高达500 mg，外皮达30～64 mg，全块茎(去芽及去皮后)约7.5～10 mg。目前，检测茄碱最常用的方法是高效液相色谱法[13]，需要对马铃薯进行榨汁提取、分离提纯等前处理过程。

图6 α-卡茄碱化学结构式Fig.6 Chemical structure of α-caconine

本实验取2份0.1 g马铃薯芽，其中1份削成薄片并切出尖端，置于铜片上，滴入0.2 mL甲醇，施加高电压用于直接电喷雾法[3]检测，其质谱图示于图7a；另1份采用在线提取瓜子壳电喷雾法分析，滴入0.2 mL甲醇，其质谱图示于图7b。两种电离方法均可得到α-卡茄碱(m/z852)质谱峰，但信号强度分别为6 580、139 473，相差2个数量级，说明样品在直接电喷雾中的电离效果弱于在线提取瓜子壳电喷雾。这是因为直接电离时只有样品表面的目标化合物被离子化；而在线提取瓜子壳电喷雾中的样品已经被压碎，其内部目标化合物同样可以被提取出来，因此在线提取瓜子壳电喷雾法的灵敏度更高。

图7 马铃薯芽的直接电喷雾质谱图(a)和在线提取瓜子壳电喷雾质谱图(b)Fig.7 Mass spectra of potato sprouts using direct ionization mass spectrometry (a) and OE-SSH-ESI-MS (b)

另取1 g马铃薯芽，搅碎拌匀，分别称取0.001、0.01、0.1 g马铃薯芽样品，放在瓜子壳上，均注入0.2 mL甲醇，获得的质谱图示于图8。可以发现，得到的谱图中α-卡茄碱的准分子离子m/z852均为最高峰，且3份样品的信号强度无明显数量级差别，说明用少量样品即可完成检测，灵敏度较高，可以用于质谱成像分析。

图8 0.001 g(a)、0.01 g(b)和0.1 g(c)马铃薯芽的在线提取瓜子壳电喷雾质谱图Fig.8 Mass spectra of 0.001 g (a),0.01 g (b) and 0.1 g (c) potato sprouts using OE-SSH-ESI-MS

以马铃薯芽为中心，测定α-卡茄碱在马铃薯不同部位的分布，其信号强度示于图9。可见，在表皮发芽的部位信号最强，随着距离变远，信号强度逐渐减弱；其次，马铃薯内部质谱信号强度降低比表面快。这说明α-卡茄碱主要存在于发芽处，并且离芽越远含量越低；其次，α-卡茄碱主要存在于表皮上，内部含量较低。

图9 马铃薯中不同位置的α-卡茄碱信号强度Fig.9 Signal intensity of α-caconine at different positions in potato

3 结论

本研究将在线提取和电喷雾质谱结合，无需样品前处理，实现了样品的高通量检测。相较于直接电离法只能分析样品表面成分，该方法可将样品内部目标化合物高效率地提取出来，具有更高的灵敏度。在α-卡茄碱检测中，利用在线提取瓜子壳电喷雾装置分析了其在马铃薯中的空间分布，检出限可达0.001 g，表明该装置通过适当的取样操作，可以应用于质谱成像。同时，该装置操作简便，瓜子壳简单易得，适用于复杂基质样品的快速检测。