miR-146b对脓毒症并发ARDS的预测及与预后的关系分析*

魏旭升，李小芳，黄 彪，王友华，陈先理

重庆市大足区人民医院重症医学科，重庆 402360

脓毒症大多因严重创伤、烧伤、外科大手术、感染等因素所致，每年患病率以1.5%～8.0%速度增长，病死率为30%～70%[1]。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是脓毒症的一种常见并发症，其发病机制比较复杂，受损部位主要为肺实质，急性发作表现包括双肺炎症、低氧血症，随着病情进展可引起多脏器功能衰竭[2]。研究表明脓毒症并发ARDS患者的病死率为50%～90%，预后非常差[3]。目前，我国现代医学取得了较大进展，针对该病治疗也提出了一些干预措施，虽然对控制病情有一定作用，但病死率仍居高不下[4]。因此，临床需寻求新的治疗靶点，为改善该病预后提供依据。近年来，有学者指出微小核糖核酸(microRNA，miR)在多种生物功能中均发挥了作用，与机体生理、病理改变有关，可能通过对脓毒症发病信号通路进行调控，参与该病进展[5]。动物实验发现，miR-146b参与了多脏器损伤过程，例如肺、肝、肾等，但作用机制不明[6]。而脓毒症并发ARDS可引起多脏器损伤，但现阶段临床尚未明确miR-146b与脓毒症并发ARDS之间的关系，基于此，本研究旨在分析miR-146b对脓毒症并发ARDS的预测价值及与预后的关系，为该病治疗寻求新靶点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2016年9月至2020年9月收治的脓毒症患者272例作为脓毒症组，纳入同期于本院体检的健康志愿者92例作为对照组。根据脓毒症组是否发生ARDS分成ARDS组、非ARDS组。脓毒症根据脓毒症3.0标准[7]进行诊断：(1)明确诊断为感染或疑似感染，同时序贯器官功能衰竭(SOFA)评分≥2分；(2)快速序贯器官功能衰竭(qSOFA)评分包括收缩压低于100 mm Hg、呼吸频率高于22次/分、意识改变3项内容，满足其中2项。ARDS诊断标准[8]：(1)已明确临床发病，或有新发呼吸症状，或加重7 d内；(2)经CT或X线片提示双侧肺透光度减低，无法通过肿瘤、肺不张、肺结节、胸腔积液等原因解释；(3)呼吸衰竭无法通过体液超负荷、心力衰竭等原因解释，若无危险因素，则经超声心动图将高静水压性肺水肿排除；(4)氧合指数低于300 mm Hg。脓毒症组纳入标准：满足脓毒症3.0标准中关于该病的诊断标准；入院后立即行血清miR-146b检测；年龄≥18岁；入院前3个月内无免疫抑制剂、激素等治疗史。对照组纳入标准：同期体检的志愿者，身体健康状况良好；在体检当日接受血清miR-146b检测；年龄≥18岁。排除标准：诊断前有心肺复苏术、器官移植术史；合并肝硬化；患艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病；病史不详；妊娠、哺乳期女性；既往有其他影响肺透光度的病史，如慢性阻塞性肺疾病。本研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象或其家属自愿签署知情同意书。两组基线资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组基线资料比较

1.2主要仪器与试剂 主要仪器：高速离心机(山东博科生物产业有限公司生产，TGL-16M)、微量移液器(赛默飞世尔科技公司生产，赛默飞F3系列)、离心管(赛默飞世尔科技公司生产，509-GRD-Q)、荧光定量聚合酶链反应检测仪(杭州博日科技有限公司生产，FQD-48A)。主要试剂：蒸馏水、异丙醇、无水乙醇均由江苏纳科科技有限公司提供；miRNA检测试剂、Trizol试剂、引物由赛默飞世尔科技公司提供。

1.3方法 两组受试者均采集3 mL空腹静脉血，3 000 r/min离心10 min，离心半径8 cm，分离血清，存至-70 ℃环境待检。利用实时反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-146b，具体操作如下。(1)提取总RNA：取出血清后常规复温，取400 μL血清放入无菌离心管(经RNA酶灭活)，加入400 μL裂解液，混匀，在室温下反应5 min；在4 ℃环境下12 000 r/min离心10 min，取上清液于新离心管内；加入400 μL氯仿，混匀30 s，在室温下反应5 min；在4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取无色水相于无菌离心管内，液体体积约600 μL；取无水乙醇200 μL加入，混匀，可见少量沉淀物，将沉淀物与液体移至吸附柱miRspin，室温下反应5 min，待吸附柱完全吸附混合液，在4 ℃环境下12 000 r/min离心30 s，弃吸附柱，留取流出液；取300 μL流出液备用，加无水乙醇200 μL，混匀，将混合液移至吸附柱内，室温下反应2 min，使吸附柱完全吸附溶液，4 ℃下12 000 r/min离心30 s，弃流出液，此时miRNA留置于吸附柱内。加入500 μL蛋白液，室温下反应2 min，在4 ℃下12 000 r/min离心30 s，取600 mL漂洗液加入，室温下反应2 min，在4 ℃下12 000 r/min离心30 s，弃流出液，重复上述操作，将miRNA以外的物质洗脱。将装有混合液的吸附柱置于新无菌离心管内，在4 ℃下12 000 r/min离心1 min，弃流出液；再次将吸附柱转入新无菌离心管内，加入30 μL RNase-Free ddH2O，室温下反应2 min，在4 ℃下12 000 r/min离心2 min，留取流出液，即获得总RNA，检测RNA浓度、纯度。(2)将RNA反转录为cDNA并进行PCR扩增。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，60 ℃退火、延伸34 s，45个循环。引物序列：miR-146b上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3′，下游引物序列为5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；内参引物U6上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATA CTA-3′，下游引物序列为5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。经2-ΔΔCt计算血清miR-146b相对表达水平。

1.4观察指标 比较各组血清miR-146b水平；收集ARDS组、非ARDS组其他资料,包括性别、年龄,是否合并高血压、糖尿病,是否有吸烟史、饮酒史、泌尿系统感染、肺部感染、胰腺炎合并胰周感染、腹腔感染、感染性休克，以及SOFA评分[以均值(四舍五入)作为截断值，将患者分为<6分组和≥6分组]、氧合指数(200～300 mm Hg为轻度，100～<200 mm Hg为中度，<100 mm Hg为重度[8])、miR-146b(水平是否大于均值)的情况，分析脓毒症患者发生ARDS的危险因素。

2 结 果

2.1脓毒症组、对照组及ARDS组、非ARDS组血清miR-146b水平比较 脓毒症组血清miR-146b水平为0.90±0.35，低于对照组的1.62±0.53，差异有统计学意义(t=14.818，P<0.001)。在272例脓毒症患者中，有82例(30.15%)发生ARDS，190例(69.85%)未发生ARDS，分别纳入ARDS组、非ARDS组。ARDS组血清miR-146b水平为0.78±0.23，低于非ARDS组的0.95±0.30，差异有统计学意义(t=4.581，P<0.001)。

2.2脓毒症患者发生ARDS的单因素分析 单因素分析结果提示，ARDS组肺部感染、胰腺炎并胰周感染、SOFA评分≥6分、氧合指数<100 mm Hg、感染性休克、miR-146b<0.90的比例均高于非ARDS组(P<0.05)，见表2。

表2 脓毒症患者发生ARDS的单因素分析[ n(%)]

续表2 脓毒症患者发生ARDS的单因素分析[ n(%)]

2.3脓毒症患者发生ARDS的危险因素多元回归分析 经Logistic多元回归模型对相关变量行量化赋值，以表3中差异有统计学意义的变量为自变量X，以是否发生ARDS为因变量Y(否=0，是=1)，结果提示肺部感染、胰腺炎合并胰周感染、SOFA评分≥6分、感染性休克是脓毒症患者发生ARDS的危险因素(P<0.05)，而氧合指数为200～300 mm Hg、血清miR-146b水平≥0.90是脓毒症患者发生ARDS的保护因素(P<0.05),见表3。

表3 脓毒症患者发生ARDS的危险因素多元回归分析

2.4血清miR-146b对脓毒症并发ARDS风险的评估价值 血清miR-146b评估脓毒症并发ARDS风险的AUC为0.793(95%CI：0.733～0.853，P<0.001，标准误：0.030)，最佳临界值为0.840，灵敏度为83.70%，特异度为70.00%。见图1。

图1 血清miR-146b评估脓毒症并发ARDS风险的ROC曲线

2.5血清miR-146b与脓毒症并发ARDS患者预后的关系分析 脓毒症并发ARDS患者血清miR-146b水平为0.78±0.23，以均值为界分成高水平组(miR-146b水平≥0.78,n=44)、低水平组(miR-146b水平<0.78，n=38)。高水平组2周内病死率为9.09%(4/44)，生存率为90.91%(40/44)。低水平组2周内病死率为42.11%(16/38)，生存率为57.89%(22/38)。2周内，miR-146b高水平组的生存率高于miR-146b低表达组，差异有统计学意义(Log-rankχ2=12.051，P=0.001)，见图2。

图2 不同血清miR-146b表达患者的生存函数图

3 讨 论

脓毒症是比较常见的急危重症，治疗难度非常大，病死率高，ARDS是脓毒症的一种严重并发症，它可增加脓毒性患者感染性休克的发生率与病死率。ARDS的发病机制可能如下：(1)机体发生感染后，可导致中性粒细胞在肺部大量聚集，促进炎症介质释放，致肺损伤加重，一旦炎症、毒素侵害肺泡巨噬细胞，则会进一步释放氧自由基，加重炎症，从而诱发ARDS；(2)机体发生感染后，大量白细胞介素、肿瘤坏死因子等释放，对炎性反应有诱导作用，导致抗炎、促炎介质处于失衡状态，炎症细胞的激活过度能诱发全身炎性反应，参与ARDS的发生过程[9]。脓毒症所致的ARDS已成为重症监护病房(ICU)病死率增加的重要因素，既往大多给予机械通气、控制感染、维护脏器功能等干预，但病死率未得到良好控制，因此，临床需积极寻求新的治疗靶点，探索新的治疗思路。研究表明miR-146b在脏器功能损害过程中可能发挥了一定作用，其可能通过调节炎症相关的信号通路，参与脏器病变进展过程[10]。因此，本研究考虑分析miR-146b在脓毒症并发ARDS中的作用机制，更深入了解该病的潜在机制，以便改善预后。

本研究结果发现，脓毒症患者的血清miR-146b水平低于健康者，且ARDS患者的血清miR-146b水平低于非ARDS患者。有学者发现，在激活、上调人单核细胞后，miR-146b水平会迅速增高，且能靶向作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，负反馈调节炎症通路，具有抑炎作用[11]。脓毒症及ARDS的发生过程则均有炎症介质参与，例如彭婷婷等[12]指出脓毒症的发生及严重程度与炎症因子水平有关，王川江等[13]则认为ARDS患者可能存在失控性炎症。在本研究中，脓毒症及脓毒症并发ARDS患者的血清miR-146b水平相对较低，这可能是因为患者机体存在炎性反应所致，血清miR-146b水平下调提示抗炎作用削弱，导致病情进展。动物实验提示，miR-146b-3p上调能对磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶信号通路介导的炎症进行抑制，从而改善脓毒症小鼠的ARDS症状，这也表明miR-146b水平与脓毒症并发ARDS有关[14]。

本研究结果显示，脓毒症患者发生ARDS可能与肺部感染、胰腺炎并胰周感染、SOFA评分、感染性休克、氧合指数有关，这些均为常见因素，与既往研究[15]结果一致。此外，本研究证实脓毒症患者发生ARDS还与miR-146b水平有关，且血清miR-146b水平对ARDS的发生存在预测价值。miR-146b可能通过负性调节炎症通路参与ARDS的发生，其水平越高，则对机体炎症的抑制作用越好，而水平越低则会加重炎症，增加发生ARDS的风险。本研究证实血清miR-146b与脓毒症并发ARDS患者预后相关，其水平≥0.90的患者生存率更高。李林成等[16]发现，miR-146b转染之后能提升脓毒症小鼠的miR-146b水平，抑制炎症介质生成，使脏器受损程度减轻，表明miR-146b对脏器功能有保护作用，也更加论证了本研究结论的可靠性。在以后的脓毒症并发ARDS治疗中，miR-146b有望成为新的治疗靶点。

综上所述，miR-146b在脓毒症并发ARDS患者血清中的表达明显下降，其对脓毒症患者并发ARDS的风险及预后均有一定评估价值。本研究局限性为收集的影响ARDS发生的单因素较少，且脓毒症并发ARDS的病例数偏少，未来还需进一步完善临床资料的收集，并扩大样本量进行深入探讨。