miR-9-3p在2型糖尿病患者血浆中表达水平及其对Sirt1蛋白表达的影响

孙雅楠 李斯 李洁

(唐山市工人医院 1内分泌二科，河北 唐山 063000；2心内四科；3妇产科)

2型糖尿病(T2DM)是一种复杂的代谢性疾病，胰岛素抵抗及胰岛素分泌相对缺乏为其主要特点，目前研究显示miR-9-3p在调节胰岛素抵抗及调节机体胰岛素分泌水平发挥重要作用〔1，2〕。国内外关于T2DM患者血浆miR-9-3p表达水平的研究较少，沉默信息调节因子(Sirt1)广泛存在于机体组织当中，能够促进胰岛β细胞分泌胰岛素、提高组织对胰岛素的敏感性，参与机体能量代谢，参与DNA损伤修复等过程，起到延缓组织细胞衰老的作用〔3～6〕。目前研究显示miR-195、miR-34a均能通过调节Sirt1的表达发挥生物学作用〔7，8〕，目前关于miR-9-3p对于HepG2细胞中Sirt1表达水平的研究未见报道。本研究通过检测T2DM患者血浆中miR-9-3p的表达水平，检测miR-9-3p对HepG2细胞Sirt1表达的影响，探讨血浆miR-9-3p在T2DM诊疗中的价值及miR-9-3p在T2DM发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2017年6月唐山市工人医院内分泌科收治住院的T2DM患者47例为T2DM组；T2DM患者纳入标准：①符合1999年世界卫生组织(WHO)诊断标准的T2DM患者；②BMI 18.5～30.0 kg/m2；③无影响糖代谢的内分泌疾病或其他疾病。T2DM诊断标准：依据1999年WHO标准即葡萄糖耐量试验：口服溶于300 ml水内的无水葡萄糖粉75 g，空腹静脉血糖 ≥7.0 mmol/L，负荷后2 h静脉血糖 ≥11.1 mmol/L。排除标准：①1型糖尿病患者；②C肽缺乏的患者；③血压≥180/110 mmHg；④肝功能异常：谷丙转氨酶(ALT)≥实验室正常值范围上限的2.5倍；⑤肾功能不全：血清肌酐≥1.5 mg/dl；⑥T2DM大血管、微血管并发症患者及近期出现糖尿病急性并发症患者；⑦近期有手术、外伤、感染及其他应激状态的患者；⑧有严重的系统性疾病，如心血管、消化、呼吸、神经、免疫、其他内分泌系统疾病等及恶性肿瘤病史；⑨目前妊娠、哺乳期的患者。另选同期年龄性别与之相匹配的医院体检中心体检健康人员28例为对照组。T2DM组男27例，女20例，平均年龄(54±10)岁，对照组男14例，女14例，平均年龄(55±7)岁，两组性别、年龄、体重指数(BMI)、胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇比较无显著差异(P>0.05)；两组空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)水平存在差异显著(P<0.001)，见表1。本研究由唐山工人医院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本的采集 所有研究对象禁食8 h，清晨空腹肘静脉采血。

1.2.2血浆总RNA的提取 使用mirVana Paris试剂盒提取血浆总RNA，按照说明书操作，置于-80℃冰箱冻存。

1.2.3cDNA的合成 应用qRT-PCR(Taqman探针法)配制RT-PCR体系，反应体系为8 μl，10×缓冲液0.8 μl、dNTP 0.2 μl、inhibition 0.1 μl、RNA 4.5 μl、RNase-free H2O 0.4 μl、RNA Primer 1.5 μl、RTase 0.5 μl，全过程均于冰浴完成。设定反应条件：16℃孵育60 min、42℃孵育60 min、85℃孵育5 min、4℃Forever。

1.2.4qRT-PCR配制 2× TaqMAN universal PCR Master Mix 10 μl、cDNA 4 μl、无核糖核酸酶(RNase-free)H2O 5 μl、TaqMAN probe 1 μl，总反应体系为20 μl；反应条件为：95℃ 10 min起始模板预变性，95℃ 15 s中模板变性、60℃ 60 s退火循环40次；每个样本均做副管，重复3次，记录实验CT值，取平均值，后经2-ΔΔCt转换后进行统计学分析。

1.3细胞实验分组及方法

1.3.1实验分组 HepG2细胞系由中国协和医科大学基础研究所细胞中心提供。实验分为两组，miR-9-3p转染组：HepG2细胞系体外转染miR-9-3p mimics，阴性对照组：HepG2细胞系体外培养不转染miR-9-3p mimics培养条件与转染组相同。

1.3.2细胞培养 将复苏后的HepG2细胞的试管加入适量含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成105/ml浓度移至培养瓶中，置于37%CO2培养箱内培养，次日更换培养液，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞生长铺满瓶壁即可传代。

1.3.3细胞转染 将配制好的miR-9-3pmimic转染复合物250 μl，加入到培养好的HepG2孔板中，再吸取Opti-MEM培养基750 μl/孔，加入到各孔中，前后轻柔摇动细胞板至混合均匀。将细胞培养板置于 37℃ 5.0%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。转染6 h后吸取1 ml普通DMEM培养基(含有20%胎牛血清、无抗生素)，加入各孔。

1.3.4细胞qRT-PCR ①提取细胞总RNA：使用mirVana Paris Kit试剂盒提取细胞总RNA，按照说明书操作，将离心管置于-80℃冰箱保存。②mRNA qRT-PCR(SYBR Green法)操作全过程需在冰浴上进行，Sirt1引物序列：上游5′ CTACTGGTCTTACTT-TGAGGG3′、下游5′CAAGGGATGGTATTTATGCT3′；β-actin引物序列：上游5′ACAGAGCCTCGCCTTTG-C3′、下游5′CCACCATCACGCCCTGG3′，反应体系如下：2×One Step SYBR®RT-PCR缓冲液410 μl、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2、1.0 μl、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1.0 μl、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μl、Total RNA 4.0 μl(400 ng)、RNase Free H2O 3 μl，总反应体系为20 μl，反应条件：反转录反应42℃ 30 min、95℃ 10 min，PCR 95℃ 10 s、60℃ 60 s循环40次。

1.3.5Western印迹细胞总蛋白的提取 细胞转染完成后应用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后应用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解获得细胞总蛋白，应用考马斯亮蓝法测蛋白浓度，之后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳过后取目的蛋白条带恒流200 mA，转膜1 h。转膜完成后，将膜用TBST水洗完后，放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。按1∶100或1∶200的比例配制一抗体与一抗稀释液，将封闭好的膜放入配好的一抗稀释液，4℃摇床过夜。按1∶1 000或1∶2 000的比例配制二抗与二抗稀释液，将膜放入配好的二抗稀释液，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.3.6考马斯亮蓝法测蛋白浓度 应用分光光度计测定并计算每管蛋白的吸光度值，制作出标准曲线。吸取3 μl待测蛋白液，加入到100 μl考马斯亮蓝显色液，用分光光度计测定并计算出吸光度值，计算出待测蛋白的浓度。

1.3.7转膜及显色 电泳分离蛋白分子，转膜，将膜放入封闭液中，在摇床上封闭1 h。加一抗，4℃摇床过夜。加二抗，常温摇床上摇3 h。二抗孵育完成后，TBST洗3次，加显色液在凝胶成像系统显色，并记录实验结果。

1.4统计学分析 采用SPSS17.0及GraphPAD Prism5.0软件进行χ2检验，t检验，非参数检验；应用受试者工作特征(ROC)曲线分析计算出ROC曲线下面积(AUC)和95%CI。

2 结 果

2.1两组血浆中miR-9-3p表达水平 T2DM组血浆miR-9-3p的表达水平〔0.033(0.004，0.209)〕明显高于对照组〔0.004(0.002，0.006),P=0.000 5〕。

2.2ROC曲线分析血浆miR-9-3p对于T2DM的诊断价值 以健康人群为对照组评价miR-9-3p对于T2DM的诊断价值，AUC=0.742，介于0.7～0.9之间，说明miR-9-3p对于T2DM诊断有一定准确性(95%CI0.628～0.857，P=0.000 5)。见图1。

2.3miR-9-3p对HepG2细胞 Sirt1转录水平的影响 HepG2细胞miR-9-3p转染组Sirt1 mRNA水平(0.877±0.255)与阴性对照组(1.003±0.429)相比，无显著差异(P=0.30)。

2.4miR-9-3p对HepG2 细胞Sirt1蛋白水平的影响 miR-9-3p转染组Sirt1蛋白水平(0.174±0.013)显著低于阴性对照组(0.623±0.044，P=0.017)。

3 讨 论

miR-9-3p在调节胰岛β细胞分泌胰岛素过程中起重要作用。Plaisance等〔9〕的研究最早证实：当胰岛β细胞内miR-9-3p表达水平升高时，miR-9-3p通过作用于转录调节因子来抑制胰岛β细胞的分泌功能。之后Ramachandran等〔10〕通过模拟糖尿病发病时体内的高糖环境再一次证实，在高糖刺激胰岛素分泌的过程中，胰岛β细胞中miR-9-3p表达水平呈显著性升高，并通过体内实验进一步证实Sirt1具有促进胰岛素分泌的作用，最后在胰岛β细胞中证实miR-9-3p的升高能够使Sirt1蛋白表达水平显著降低。郭东更等〔11〕以新发的T2DM患者和正常糖耐量人员外周血单个核细胞为研究对象，研究结果表明初发T2DM患者外周血单个核细胞中miR-9-3p水平显著上调，并且其三酰甘油水平也是上调的。

Sirt1对于提高组织胰岛素敏感性、促进胰岛素分泌和调节脂类代谢的平衡发挥重要作用，目前研究证实，若降低Sirt1蛋白表达水平或降低其蛋白活性均能够导致胰岛素抵抗的发生，科学家检测出高脂饮食饲养的小鼠体内Sirt1蛋白质水平显著降低并且小鼠表现为过早衰老〔12，13〕，除此之外，人工培养的胰岛素敏感细胞如HepG2细胞及平滑肌细胞中，如抑制Sirt1蛋白的表达水平会促进胰岛素抵抗的发生〔14〕。Adlakha等〔15〕运用免疫印迹法证实，在HepG2细胞中miR-128通过介导Sirt1表达水平进一步调节ATP结合盒转运蛋白G1的表达水平，参与体内脂质代谢。Nakae等〔16〕研究显示，肥胖小鼠肝脏特异性敲除Sirt1基因的表达，不仅升高小鼠血糖水平，增加胰岛素抵抗的产生，同时检测到游离脂肪酸和胆固醇水平显著提高，证明Sirt1在提高胰岛素敏感性及调节血脂方面具有重要作用。也有研究证实，在HepG2细胞和小鼠肝脏中增加Sirt1蛋白表示水平，能够激活基底腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)-激活蛋白激酶，能够防止脂肪酸合酶诱导的脂质聚积及其所引起的血糖水平升高及胰岛素抵抗〔17〕。本研究证实miR-9-3p调节Sirt1蛋白水平的表达。证实miR-9-3p通过转录后水平调节HepG2细胞 Sirt1表达。本研究通过细胞试验进一步证实miR-9-3p能够靶向抑制Sirt1蛋白的表达，参与调控胰岛素抵抗和脂质代谢途径，对T2DM胰岛素抵抗及血脂异常的发生可能起到促进作用。