应用CRISPR/Cas9 介导的基因编辑系统研究B 细胞中转录因子T-bet的调控作用

韩夏夏，顾霜霜，戴 黛，沈 南

上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科，上海风湿病学研究所，上海 200127

B 淋巴细胞是适应性免疫系统的重要组成部分。B 细胞产生抗体，可以识别特异性的抗原，一方面通过抗体的中和作用，减少机体与病原体的接触；另一方面抗体可以活化下游巨噬细胞和自然杀伤细胞等，通过抗体依赖的细胞毒作用（antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC），参与免疫反应［1］。抗体发挥效应功能不仅依赖于抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）识别抗原，更需要通过抗体Fc（fragment crystallizable）端结合能表达抗体Fc 受体的效应细胞发挥差异性的免疫调控功能。抗体的Fc 端决定了抗体的类型［2-3］，Fc 端的转变，即抗体的类别转换，由细胞本身和微环境决定。抗原对B 细胞的激活、微环境中细胞因子的刺激等，最终由多种调控元件协同作用介导重链（IgH）位点的DNA 删除实现抗体的类别转换［1，4］。例如，受γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）诱导的转录因子T-bet （编码基因为T-box 21，缩写Tbx21）是IgG2a/c 类别转换中重要的调控分子，在B 细胞中敲除Tbx21基因，能够有效抑制IgG2a/c 抗体产生［5］。然而T-bet 对B 细胞类别转换的精确调控机制仍不明确。

目前对B细胞调控分子和信号通路的研究大多通过基因工程的方式实现。传统构建条件性基因敲除小鼠的方法主要是通过Loxp 位点和Cre 重组酶实现在小鼠体内B细胞中定向基因敲除，研究基因在体内外对B 细胞的调控功能；但该方法不仅花费时间较长，经济成本较高，而且构建的模型小鼠还存在Cre 酶编码序列部分被替代的可能，影响基因敲除的效率［6］。常规的体外功能研究技术包括：①通过小干扰RNA、微RNA 和发夹RNA 进行分子敲低，但其受到敲除效果稳定性、瞬时性和敲除效率的影响。②通过病毒递送过表达载体，但其受到基因大小的限制。近些年CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术快速发展，得以应用于小鼠原代免疫细胞的基因编辑，可以靶向特定的目的基因，为研究分子转录提供了强有力的工具［7］。课题组前期成功利用Cas9转基因小鼠和小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）反转录病毒载体成功实现原代T细胞的基因敲除［8］。但该系统运用到B 细胞中时，需要考虑到B 细胞分化、激活条件的特异性，优化质粒递送体系，才能在B细胞基因的研究中也成功实现基因编辑。

本研究通过优化病毒感染条件，利用浓缩的高滴度反转录病毒感染充分活化的小鼠原代B细胞，进行高效的基因编辑。以原代B细胞类别转换中重要的转录调控分子T-bet 为例，利用该系统验证敲除Tbx21基因对抗体IgG2c 产生的抑制作用，旨在为B 细胞基因功能研究提供一个简单、快速、高效的基因编辑系统和研究手段。

1 对象与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

1.1.1 实验动物及细胞 8～10 周龄C57BL/6J 小鼠（JAX000664）和Cas9-EGFP 小鼠（JAX026175），雌性，体质量20～25 g，购自美国杰克森实验室。所有实验小鼠饲养在上海交通大学医学院附属仁济医院SPF 级动物房，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0013。小鼠自由饮食，饲料用60Co 辐照杀菌。饲养环境：温度22～24 ℃，空气相对湿度40%～60%，光照周期为12 h/12 h。

Plat-E 病毒包装细胞购自中国科学院细胞库。采用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 的DMEM 培养基，放置在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞复苏24 h后显微镜下观察细胞状态和细胞密度，达到约80%密度即可传代。本实验中所用细胞为第3～4代指数生长期的细胞，细胞状态良好。

1.1.2 主要试剂及仪器 小鼠B 细胞分选试剂盒、LS 分选柱（Miltenyi，德国），抗B 细胞受体（B cell receptor，BCR）抗体（Jackson Immunoresearch，英国），抗小鼠CD40 抗体（Biolegend，美国），Toll 样受 体 （Toll-like receptor， TLR） 激 动 剂 R848（InvivoGen，美国），胰蛋白酶、Opti-MEM 无血清培养基、DMEM、RPMI-1640、FBS、非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）、丙酮酸钠、谷氨酰胺和抗生素（Gibco，美国），BD Cytofix/Cytoperm™细胞固定/破膜试剂盒（BD Biosciences，美国），Lipo2000 转染试剂（ThermoFisher Scientific，美国），T4 连接酶（NEB，美国），血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（天根，中国），小鼠免疫球蛋白面板 （SBA Clonotyping System-C57BL/6-HRP，SouthernBiotech，美国），APC 标记的抗小鼠/人T-bet抗体（Clone 4B10）、PE/Cyanine 5 标记的抗小鼠CD19 抗体（Clone 6D5）、死活细胞染料（Zombie Aqua™Fixable Viability Kit，Cat#423102）、生物素标记的抗小鼠CD16/32 抗体（封闭抗体，Clone 93）（BioLegend，美国）。U6-PGK-Puro-BFP 载体由本实验室自行构建。

超净工作台、CO2培养箱、DNA Thermal Cycler 9700 PCR 仪（Thermo Scientific，美国）、Centrifuge 5801R 离心机（Eppendorf，德国），流式细胞分选仪Aria Ⅲ、 流 式 细 胞 分 析 仪Fortessa X-20 （BD Biosciences，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 基因集富集分析 使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 软件（Broad Institute）进行分析。经转录组测序（RNA-seq）得到的基因表达谱（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）来自于GEO 公共数据库的数据集GSE84948 和GSE83697。本研究分析所用的功能基因集均来源于Molecular Signatures Database（https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）。对于分析结果，一般认为|NES|>1，NOMP-value<0.05，FDRq-value<0.25（NES 是normalized enrichment score 的 缩 写，NOM 是nominal 的 缩 写，FDR 是false discovery rate 的缩写）的通路下的基因集合是有意义的。

1.2.2 sgRNA/Cas9 表达载体的构建 sg-Tbx21和sg-NC 序列通过在线网站（http：//chopchop.cbu.uib.no/）设计，以单链的形式合成（序列见表1），并在以往的实验结果中得到验证［9-10］。选择U6-PGK-Puro-BFP为sgRNA/Cas9 的表达载体，将其进行酶切电泳、回收得到线性载体。将合成的sgRNA 体外复性得到双链后，通过T4 连接酶与上述酶切后的线性载体4 ℃连接过夜，然后进行转化实验，次日挑取单菌落进行测序。测序成功的菌株抽提质粒备用。

表1 sgRNA功能序列及单链引物Tab 1 sgRNA functional sequences and single strand primers

1.2.3 反转录病毒包装 提前1 d，将8×106个Plat-E细胞种植在10 cm 培养皿，使用Lipo2000进行质粒转染。取750 μL Opti-MEM 无血清培养基，加入15 μg sgRNA 反转录病毒载体；另取750 μL Opti-MEM 加入30 μL Lipo2000，室温孵育5 min。将这2步所得的混合液混匀，室温放置15 min 后，加入培养皿中。转染6 h后细胞换液，48 h后收集上清液，0.45 μm孔径细胞滤网过滤后，4 ℃下20 133×g离心浓缩2 h，置于4 ℃冰箱备用，1周内使用。

1.2.4 B 细胞分离及体外激活培养 分离8～10 周龄的C57BL/6J 小鼠和Cas9-EGFP 小鼠脾脏，经研磨和40 μm 孔径滤网过筛后得到细胞混合液，离心后裂解红细胞。按照小鼠B细胞分选试剂盒说明书分离小鼠初始B 细胞。每107个脾脏总细胞用40 μL 预冷的磁珠活化细胞分选（MACS）缓冲液重悬，加入10 μL生物素标记的混合抗体（biotin-antibody cocktail），混匀，4 ℃反应5 min。然后按每107个脾脏总细胞加入30 μL 预冷的MACS 缓冲液，再加入20 μL 抗生物素磁珠，混匀，4 ℃反应10 min。等待间隙，将LS分选柱放置在磁力架上，用1 mL 的MACS 缓冲液预先润洗2～3 次。将细胞加到LS 柱里，用15 mL 离心管收集LS 柱流下的细胞液，再用MACS 缓冲液冲洗LS 柱3 次。将所有LS 柱流下的液体于4 ℃下400×g离心5 min。去上清液后，培养基重悬进行细胞计数，之后于24 孔板（1×106个/孔） 内激活B 细胞，用500 ng/mL R848、1 μg/mL抗CD40抗体和1 μg/mL抗BCR抗体刺激24 h。

1.2.5 反转录病毒感染小鼠B细胞 收取激活后的B细胞，计数，再次铺板，每孔2×105个细胞，并加入200 μL病毒和聚凝胺的混合液；32 ℃，1 260×g离心90 min。离心结束后，放入37 ℃的CO2培养箱中进行培养。6 h 后弃去病毒上清液，加入B 细胞分化培养基（RPMI-1640、10%灭活FBS、10 mmol/L 羟乙基哌嗪乙硫磺酸、NEAA、2 mmol/L 丙酮酸钠、0.05 mmol/L β-巯基苯酚、2 mmol/L谷氨酰胺），体外诱导3 d，进行后续流式分选检测敲除效率。

1.2.6 免疫细胞流式染色与分析 收集分化后的B细胞，离心去上清液，用MACS 缓冲液重悬，制备成单细胞悬液，配置细胞表面CD19 抗体、死活细胞染料与封闭抗体的混合液，每个样本加入50 μL 染色体系，4 ℃避光反应20 min。MACS 缓冲液清洗后进行流式检测。在表面染色之后，用细胞固定/破膜试剂盒对细胞进行固定和破膜，每个样本加入50 μL 固定液，4 ℃反应20 min，再进行核内T-bet染色，加入T-bet 抗体室温避光反应30 min。离心去上清液后用检测液重悬细胞，上机进行流式检测。用FlowJo 软件分析结果。

1.2.7 检测靶基因敲除效率 使用细胞抽提基因组DNA 试剂盒提取经细胞分选和病毒感染的B 细胞基因组DNA，针对sg-Tbx21靶向区域的上下游设计引物（表2），PCR 扩增待检测DNA 片段。PCR 条件为94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，30 个循环；72 ℃5 min。对得到的PCR 产物进行序列测通，利用ICE CRISPR 分析工具计算基因敲除效率。

表2 PCR引物序列Tab 2 Primers for PCR

1.2.8 ELISA 法检测抗体丰度 使用小鼠免疫球蛋白面板，按说明书操作检测IgG2c、IgG3 和IgM 3 个类别抗体的滴度。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行分析。定量资料用±s表示，2 组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 T-bet促进抗体类别转换相关通路的上调

小鼠的体液免疫反应通常分为以Th1 细胞因子IFN-γ 为主的偏向于IgG2a/c 抗体产生的反应，以及以Th2 细胞因子IL-4 为主的偏向于IgG1 抗体产生的反应［11］。IFN-γ 下游的T-bet 是主导IgG2a/c 类别转换的转录因子［12-13］。通过挖掘GEO 公共数据库中数据集GSE84948，对IFN-γ 诱导分化的B 细胞（Be1 细胞）与IL-4 诱导分化的B 细胞（Be2 细胞）的RNA-seq 结果进行重分析，发现IFN-γ 诱导分化后，转录因子Tbx21基因的表达水平明显上升，Ighm（immunoglobulin heavy constant mu）、Ighg［immunoglobulin heavy chain （gamma polypeptide） ］ 和Ighg3（immunoglobulin heavy constant gamma 3） 的水平也明显上升（图1A）。GSEA 结果显示，与Be2 细胞相比，DNA 重组（DNA recombination） 和IgG 同种型转换（isotype switching to IgG isotypes）通路在Be1 细胞中明显上调（图1B）。通过对GSE83697 数据集中IFN-γ 诱导分 化 的B 细 胞（Be1 细 胞） 和T-bet 敲 除B 细 胞（Be1.Tbet-ko 细胞）的测序结果进行分析，发现在Be1.Tbet-ko 细胞中，DNA 重组通路明显下调（图1C）。这些数据进一步表明，IFN-γ 诱导的B 细胞内表达的T-bet 是调控B 细胞抗体类别转换的重要转录分子［14］。

图1 T-bet参与调控抗体分泌细胞的抗体类别转换Fig 1 T-bet involved in regulating antibody isotype switching in antibody secreting cells

2.2 构建高效编辑原代B 细胞基因的CRISPR/Cas9系统

为了建立用于小鼠原代B 细胞基因功能研究的高效CRISPR/Cas9 系统，我们借鉴了前期成功构建的反转录病毒sgRNA 表达载体（U6-sgRNA-PGKPuro-BFP）和Cas9转基因小鼠［8，15］，并且进一步优化感染条件。我们分离小鼠原代B 细胞，加入R848、抗CD40 抗体和BCR 共培养激活24 h 后收取细胞，通过流式细胞术检测激活后B 细胞的前向和侧向散射光（FSC 和SSC），发现协同刺激后的B 细胞明显变大（图2A）。除此之外，感染细胞时病毒消耗量较大，因此获得高滴度的病毒颗粒也是提高病毒感染效率的重要因素。由于工具细胞的生长状态、目的基因大小、表达载体、转染效率等都会影响病毒包装效率，为了获得稳定的高滴度病毒颗粒，且减少直接收集的病毒上清液对后续感染细胞活性的影响，本研究对原先感染操作进行优化：在质粒转染细胞48 h后收取病毒上清液，高速离心后获得病毒浓缩液，感染已激活的B 细胞。结果显示，与未优化组（用直接收集的病毒上清液感染未激活的B 细胞）相比，优化组细胞活性较好，蓝色荧光蛋白（BFP）阳性细胞比例可达到69.8%（图2B）。表明原代小鼠B细胞充分激活并采用浓缩后的高滴度病毒颗粒感染可具有较高的感染效率。

图2 编辑原代B细胞基因CRISPR/Cas9系统的感染条件优化Fig 2 Optimization of infection conditions of CRISPR/Cas9 system for editing genes of primary B cells

2.3 反转录病毒感染B细胞后敲除T-bet的验证

为了验证该系统是否能用于B 细胞的基因敲除，对设计合成的sgRNA 进行克隆和病毒包装。分离Cas9转基因小鼠B 细胞，激活24 h 后，进行反转录病毒感染。3 d 后进行流式分选时发现，感染B 细胞（CD19+GFP+BFP+）的比例可达65.7%（图3A）。对流式分选后的感染B 细胞抽提基因组DNA，并围绕sg-Tbx21靶向位置上下游设计引物进行PCR 扩增后送测序。结果显示：目的sgRNA 在T-bet 靶向序列位点上引入indel 效率为78%，T-bet 分子的敲除效率约为59%（图3B），表明利用该系统可以有效地对小鼠原代B细胞进行靶基因敲除。

图3 反转录病毒感染B细胞后T-bet敲除效率检测Fig 3 T-bet knockout efficiency of T-bet in the retrovirus-infected B cells

2.4 T-bet在B细胞中参与调控IgG2c的产生

为了进一步研究T-bet 在B 细胞抗体类别转换中的作用，利用CRISPR/Cas9系统，在反转录病毒感染后的B 细胞中加入IFN-γ 等浆细胞分化所需的细胞因子和抗体进行体外诱导分化，通过流式细胞仪检测B细胞核内T-bet 的表达水平。结果发现，与sg-NC 组相比，sg-Tbx21组中，感染后的B 细胞中T-bet 的表达水平明显降低（图4A）。浆细胞分化完成后，收集细胞上清液，通过ELISA 检测各个类别抗体丰度，结果发现T-bet被敲除后IgG2c 的水平明显降低，IgM和IgG3 的水平未有明显的变化（图4B）。表明T-bet在IgG2c的产生过程中起着重要的调控作用。

图4 B细胞中T-bet被敲除后对抗体IgG2c水平的影响Fig 4 Effect of T-bet knockout in B cells on IgG2c production

3 讨论

免疫细胞中有效并且可及的基因干预手段对于研究免疫细胞的一些特征和功能具有重要意义，但是与T 细胞基因工程工具的广泛开发不同，应用于B 细胞上的干预手段相对缺失。虽然近年来CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术快速发展，得以应用于小鼠原代免疫细胞基因编辑，但仍存在很多局限性，如编辑效率、脱靶效应、同源重组效率低下等［16］。CRISPR/Cas9 基因组编辑技术依赖于sgRNA 和靶DNA 的碱基互补配对来识别靶位点［17］，未激活的原代免疫细胞处于静息状态，转录本开放程度较低，sgRNA 序列整合到基因组的能力较低，从而导致基因编辑效率较低，因此细胞充分活化是提高原代免疫细胞基因编辑效率的一个重要前提。除此之外，细胞活化后，细胞变大，与病毒颗粒接触的表面积增加，有利于病毒遗传物质整合到细胞基因组上，提高了Cas9 蛋白-sgRNA 复合物靶向结合到编辑位点的效率。与T 细胞类似，B 细胞激活也需要同步信号。本研究中通过BCR、CD40 和TLR 信号协同作用，可以充分动员下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase， MAPK） 和 核 因 子κB（nuclear factor κB，NF-κb），促进B 细胞的活化和功能［18-19］。在提高感染效率方面，我们通过浓缩病毒代替直接收集的病毒上清液，一方面是为了获得稳定的高滴度病毒颗粒，另一方面是因为一般病毒收集时，培养基的营养损耗较大，且含有多种代谢产物，直接培养感染细胞会损害细胞活性。结果显示，优化组无论是细胞活性还是感染效率都远远高于未优化组。并以敲除T-bet为例，利用ICE CRISPR 分析工具检测功能基因的编辑效率，并检测感染后B细胞在浆细胞分化条件诱导下，上清液中各个抗体类型的丰度，分析结果显示T-bet 敲除效率大大提高，并且有效抑制IgG2c型抗体的产生。

B 细胞产生的抗体发挥生物学作用既依赖Fab 端的识别，更受到类别转换后的Fc 端类型及其下游效应细胞的影响。通过对公共数据库中基因表达谱的分析发现，IFN-γ信号和下游的T-bet分子可促进抗体类别转换信号通路的活化［12-13］。利用优化的原代B 细胞病毒感染系统，高效地将sgRNA 导入到表达Cas9蛋白的B 细胞中，实现Tbx21基因的有效编辑；并且在编辑后的B 细胞，发现T-bet缺陷确实抑制了IgG2c抗体类型的转换。这些结果进一步为T-bet 分子参与B 细胞抗体类别转换的调控提供了证据。除此之外，T-bet 分子被发现在衰老/自身免疫相关B 细胞（age/autoimmune-associated B cell， ABC） 中 高 表 达，ABC 是近年来发现的在多种自身免疫疾病、感染和衰老中均有重要功能的新型B 细胞亚群，T-bet 是调控ABC 发育和功能的重要转录因子［20-21］。本研究所构建的Cas9 介导的原代B 细胞基因编辑手段，将有助于深入研究T-bet分子对B细胞功能的研究。

综上，本研究使用CRISPR/Cas9 系统，通过优化感染条件，利用浓缩的高滴度反转录病毒感染活化增殖的小鼠原代B 细胞，高效编辑小鼠原代B 细胞中的靶基因，以T-bet 为例，验证了敲除T-bet 能够抑制B 细胞IgG2c 抗体类别的产生，极大地发展了原代B 细胞中的基因干预手段，未来可有效利用该系统研究B 细胞基因功能及抗体产生过程中的调控机制。

利益冲突声明/Conflict of Interests

所有作者声明不存在利益冲突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

伦理批准和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有动物实验均已通过上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物伦理委员会的审核批准（编号：2019-0103）。所有动物相关操作均按照上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物伦理委员会的规定执行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine（Approval Letter No. 2019-0103）， and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Institutional Animal Care and Use Committee at Renji Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine.

作者贡献/Authors'Contributions

沈南、戴黛参与了实验设计；沈南、戴黛、韩夏夏参与了论文的写作和修改；韩夏夏、顾霜霜参与了实验操作和数据处理。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。

The study was designed by SHEN Nan and DAI Dai. The manuscript was drafted and revised by SHEN Nan， DAI Dai and HAN Xiaxia.The data was acquired and analyzed by HAN Xiaxia and GU Shuangshuang. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-01-24

·Accepted：2022-04-25

·Published online：2022-04-28