草珊瑚地上部分不同采收时间、不同部位有效成分含量研究

雷琳琳，李金玲，曹国璠，王华磊，罗春丽，李丹丹，罗夫来，罗蓉，石敏

（1.贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省药用植物繁育与种植重点（工程）实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省凯里市榕江县林业局，贵州 凯里 557200）

草珊瑚[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]别称肿节风、九节茶，为金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物，具有清热凉血、祛风通络、活血消斑等功效，用于治疗血热紫斑、紫癜、风湿痹痛、跌打损伤及肿瘤等症[1-3]。其野生资源主要分布于我国安徽、浙江、江西、福建、台湾、广东、广西、湖南、四川、贵州和云南等省[4]。草珊瑚主要用于治骨折和跌打损伤瘀肿等，其中，贵州黔东南州苗医药的九节茶药制作工艺在2008 获得第二批国家级非物质文化遗产代表性项目名录[5]，目前，黔东南草珊瑚野生资源达到约5 400 hm2，野生抚育约1 300 hm2。而中药材的有效成分含量与采收期有直接关系，通过对不同时期、不同部位草珊瑚有效成分的测定，选择适宜的采收期对提高草珊瑚质量以及充分利用资源有重大意义。现阶段，草珊瑚采收期对其有效成分含量影响的相关研究较少，只有徐翔英等[6]对产自福建省的草珊瑚中的7 个有效成分进行过分析研究，包侠萍[7]对厦门地区的草珊瑚的不同部位及不同采收期有效成分含量进行了考察研究，但对贵州产地的草珊瑚含量、采收期等方面的研究鲜少涉猎，仅停留在对草珊瑚的种植方式、发展潜力方面的研究。研究表明，草珊瑚主要含有香豆素、有机酸、黄酮及挥发油等类化学成分[8,9]。中国药典中规定的草珊瑚有效活性成分异嗪皮啶有抗肿瘤功效，而酚酸类具有抗菌消炎的功效[10-14]。除此之外，基于贵州榕江地区药农在采收时为保留贵州草珊瑚野生资源，只采收野生草珊瑚的地上部分，因此，本实验通过HPLC 法对草珊瑚地上部分新绿原酸、隐绿原酸、迷迭香酸和异嗪皮啶4 种有效成分的含量进行测定，筛选科学、最佳的采收期，为贵州黔东南州野生草珊瑚的适宜采收期提供一定的理论依据。

1 材料、仪器以及试药

1.1 材料

草珊瑚药材采于贵州省黔东南州榕江县。采样采用5 点取样法，每个点取6 株草珊瑚，共取30 株。为方便记录，将榕江县野生草珊瑚基地记为A 区，A 区海拔713 m，草珊瑚生长坡向为东南135°，坡度为45°，伴生植被为阔叶林。A 区茎部7~12 月分别记为编号1~6，叶部7~12 月分别记为编号7~12。

1.2 仪器

Agilent1260 infinity 型高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]、RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、PX85ZH 型电子天平[奥豪斯仪器（常州）]有限公司。

1.3 试药

异嗪皮啶（批号：DSTDY001001）、迷迭香酸（批号：DSTDM002701）、隐绿原酸（批号：DSTDY003501）、新绿原酸（批号：DSTDX001503）面积归一化法计算纯度均大于98.0% ，药品均从乐美天医药（德思特生物）购买。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

分别精密称取新绿原酸、迷迭香酸、异嗪皮啶及隐绿原酸对照品适量，加入色谱甲醇配制成质量浓度为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.4 mg/mL 和0.4 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取草珊瑚茎、叶粉末（过3 号筛）2 g，精密称定，置于250 mL的锥形瓶中，用体积分数50%的甲醇50 mL 浸泡30 min，加热回流1.5 h，放冷，过滤，取滤液，减压蒸干，残渣加色谱甲醇10 mL 溶解，过滤，取滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱: Agilent C18 色谱柱（250 mm 4.6 mm，5m）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~10 min，15% A；10~18 min，15% →25% A；18~30min，25%A），流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：330 nm，进样量：10L。在该色谱条件下，对照品及供试品色谱图见图1。

图1 草珊瑚样品（A）与混合对照品（B）HPLC 图Fig.1 HPLC Chromatograms of samples(A)and reference substances (B)

2.4 线性关系考察

分别精密称取新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸，甲醇溶解配制成质量浓度分别为0.240 g/L、0.391 g/L、0.383 g/L 和1.800 g/L，新绿原酸进样量分别为0.1L、2L、3L、4L 和5L，隐绿原酸进样量分别为0.1L、0.5 L、1.5 L、2 L、2.5 L 和3.2 L，异嗪皮啶进样量分别为0.1 L、1 L、2 L、3 L、4 L 和5 L，迷迭香酸进样量分别为0.1 L、2 L、4 L、6 L 和8 L[15]。在“2.3”项下色谱条件进样分析，以峰面积（y）为纵坐标，以进样浓度（x，g/mL）为横坐标，绘制标准曲线，新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸对照品的标准曲线、回归方程及线性范围见表1。

表1 草珊瑚4 个有效成分回归方程及线性范围Table 1 Regression equations and linear ranges of four active components of Sarcandra glabra

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶及迷迭香酸平均峰面积分别为411.66、809.233、605.03和857.116，RSD（n=6）分别为1.222%、1.295%、1.528%和1.671%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取同一干燥方式草珊瑚药材（编号8）粉末2 g，共6 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件进样，记录峰面积。新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸的平均峰面积分别为167.06、307.7、142.78 和2 507.26，RSD分别为0.052%、1.124%、1.762%和0.025%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号4），在0 h、2 h、4 h、8 h、18 h 和24 h 分别按“2.3”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸的峰面积分别为659.15、1 120.633、840.55和9 725.05，RSD 分别为1.482%、1.751%、1.023%和1.280%，表明供试品溶液中上述4 个成分在24 h 内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量的草珊瑚粉末（编号5）2 g，共6 份，分别称取一定量的对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，除进样量为5L 外，其余步骤均按“2.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算加样回收率，见表2。

表2 草珊瑚4 个化学成分的加样回收率试验结果（n=6）Table 2 Test results of sample recovery of four chemical components of Sarcandra glabra (n=6)

2.9 样品含量测定

精密称取不同采收期、不同部位的草珊瑚样品粉末2g，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶和迷迭香酸的含量。

2.10 数据处理

试验数据采用Excel 表格，利用SPSS 22.0 统计分析软件对数据进行方差分析和显著性检验。

3 结果与分析

3.1 不同采收期下A、B两区草珊瑚茎部4个有效成分含量比较

由表3 可知，在A 区草珊瑚7~12 月的采收月份中，从草珊瑚茎中检测的4 种成分含量存在差异，在9月份4 种有效成分含量都是最低的，其中隐绿原酸、迷迭香酸在11月份含量最高，最高含量分别为0.038%、0.383%。11 月份，隐绿原酸含量显著高于其余月份，与7 月、8 月、9 月和12 月份含量达极显著差异，与10月份差异不显著。11 月份迷迭香酸含量与其余5 个月份含量都达极显著差异。新绿原酸在10 月份含量达到最高，含量达到0.024%，与7 月、8 月、9 月和12 月含量差异达到极显著水平，与11 月份含量差异不显著。异嗪皮啶含量在8 月份达到最高，达到0.057%，与其余5 个月份含量差异达到极显著。

表3 A 区草珊瑚茎部4 个有效成分含量表（%）Table 3 Contents of 4 active components in the stems of Sarcandra glabra in area A (%)

3.2 不同采收期下A区草珊瑚叶部4个有效成分含量比较

由表4 可知，A 区7~12 月的采收期中从草珊瑚叶中检测的4 种有效成分含量在9 月份依旧是最低的，这与在茎部测定的结果相一致，新绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶以及迷迭香酸4 种有效成分在11 月份含量是最高的，分别为0.021%、0.029%、0.008%和0.645%且含量与其余采收月份含量差异达到极显著水平。叶片中新绿原酸、迷迭香酸含量在11 月份达到最高与茎部中相一致，异嗪皮啶在叶片中的含量明显低于茎部，且最高含量月份也不相同，茎部中含量在8月份达到最高，为0.057 %，叶片中含量在11 月份最高，为0.008%。

表4 A 区草珊瑚叶部4 个有效成分含量表（%）Table 4 Contents of 4 active components in leaves of Sarcandra glabra in area A (%)

3.3 不同采收期下整株草珊瑚中异嗪皮啶、迷迭香酸含量比较

通过对草珊瑚样品干重茎叶比，得到整株草珊瑚中迷迭香酸、异嗪皮啶的平均含量（表5），A 区7~12月6 个采收月份迷迭香酸含量均能达到药典标准（＞0.020%），在11 月份达到最高，最高达0.467%。A 区除了9 月份，异嗪皮啶含量达不到药典含量标准（0.014%＜0.02%），其余月份均能满足药典标准（＞0.020%），在8 月份达到最高，最高为0.046%。因此，A区9 月份不建议进行草珊瑚采收。

表5 A 区草珊瑚地上部分异嗪皮啶和迷迭香酸的平均含量Table 5 Average content of isofraxidin and rosmarinic acid in whole Sarcandra glabra in area A and area B

4 讨论与结论

4.1 讨论

在贵州省榕江地区，不同采收期对草珊瑚有效成分含量有着明显的影响，由于草珊瑚是全株入药，《中国药典》2015 年版一部中草珊瑚的采收季节定为夏秋两季，采收期较长，并不明确[6]。本试验考察不同采收期、不同部位、不同地区草珊瑚有效成分含量，通过HPLC 法同时测定草珊瑚中4 个有效成分，得出各成分最佳采收期以及不同部位的含量，为贵州榕江地区草珊瑚的采收以及质量研究提供一定的理论依据，也为草珊瑚含量的测定方法提供一定的理论基础，为进一步优化测定方法提供依据。本试验通过测定7~12 月各时期有效成分含量得出草珊瑚茎中新绿原酸、隐绿原酸和迷迭香酸3 种有效成分均在11 月份达到最佳，新绿原酸、隐绿原酸成分与徐翔英、衷林清等[6]的研究一致，而迷迭香酸11 月达到最佳，与前人研究的结论迷迭香酸在8~10 月份含量较高有些许差异，主要因为地区环境、海拔以及品种等差异的原因导致，本试验所采集地区的草珊瑚迷迭香酸含量也要比其高得多。异嗪皮啶在8 月达到最佳，我们可根据所需草珊瑚的不同有效成分来选择草珊瑚的采收时期。

本试验通过测定7~12 月各时期有效成分含量得出草珊瑚茎中新绿原酸、隐绿原酸和异嗪皮啶3 种有效成分含量均高于叶片中含量，而迷迭香酸含量叶片中高于茎部中，这与包侠萍[7]的研究一致。因此，根据所需有效成分的差异，选择不同部位进行采收提取。

本试验中选取了7~12 月6 个不同采收期，通过对有效成分含量进行测定，结果表明不同的采收期会引起有效成分含量的显著变化，药典规定的两种有效成分迷迭香酸和异嗪皮啶，其中迷迭香酸含量均能达到药典标准（＞0.020%），其中11 月份含量达到最高。而异嗪皮啶含量除9月份外均达到药典标准（＞0.020%），故而9 月份不建议进行草珊瑚采收。

4.2 结论

本试验中选取了7~12 月6 个不同采收期下贵州野生草珊瑚茎、叶片两个部位来进行有效成分含量测定，新绿原酸、隐绿原酸以及异嗪皮啶在同一个采收期同一个地区，其茎部位含量要比叶片部位含量高，特别是异嗪皮啶含量差异明显，而迷迭香酸刚好与之相反，叶片含量要远远高于茎部含量。其中9 月份异嗪皮啶含量未达到药典标准，因此9 月份不进行草珊瑚采收。除在茎中异嗪皮啶含量在8 月达最高外，其余3 种有效成分含量均在11 月达到最高，故需较高含量的新绿原酸、隐绿原酸和迷迭香酸选择在11 月进行采收，异嗪皮啶选择在8 月采收。