哈密淖毛湖主栽甜瓜病原微生物分离及鉴定

王志慧，霍向东，李江峰，翟 勇，李佩琪，秦新政

(1. 新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2. 哈密市农业农机技术推广服务中心，新疆哈密 839001；3. 哈密隆泰农业科技有限公司，新疆哈密 848400；4.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐，830046)

0 引 言

【研究意义】新疆哈密地区年均日照时数长达3 358 h，是全国日照时数最多的地区之一，适于甜瓜(CucumismeloL.)的栽培。其中哈密淖毛湖地区作为甜瓜传统种植区，一直以其作为当地重要的经济作物[1-3]，该地区早、中熟甜瓜产区面积1 733 hm2(2.6万亩)，中、晚熟甜瓜产区面积3 333 hm2(5万亩)[4]，存在连作现象，甜瓜病害发生严重[5]。【前人研究进展】长期连作可能会造成甜瓜土传病害发生严重，随种植年限延长主要病原真菌核盘菌属(Sclerotinia)、轮枝孢属(Verticillium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌(Fusarium)等菌种数量增加[5]；甜瓜主要病害包括甜瓜枯萎病、甜瓜蔓枯病、甜瓜炭疽病、甜瓜白粉病、甜瓜霜霉病、甜瓜细菌性果斑病及甜瓜疫病等[6]。甜瓜枯萎病在整个生长周期均可发病，严重时发病率达30%～50%，影响甜瓜产量和质量[7]；甜瓜蔓枯病主要危害甜瓜的茎、叶、瓜及卷须等[8]；甜瓜炭疽病主要危害果实，严重时发病率超过50%[9]；甜瓜白粉病主要危害茎和果实的生长发育，降低甜瓜果实品质和产量等[10]。【本研究切入点】膨大期是甜瓜病害集中爆发期，而目前甜瓜防治措施主要是在出现病症前期或中期根据病害类型化学防治，忽略了病原微生物潜伏期的防治，对膨大期发生的病害防治手段有限，有必要对该时期健康株及病株病原微生物进行深入研究。【拟解决的关键问题】选择哈密淖毛湖地区主栽甜瓜品种黄86及西州蜜17号，在其膨大期健康、发病植株的病原微生物进行分离和鉴定，对比健康株及病株样品中的微生物，研究潜在的病原菌及微生物病害种类，为哈密淖毛湖地区主栽品种的甜瓜病害防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 甜瓜品种

采集哈密地区主栽甜瓜品种西州蜜17号和黄86的膨大期健康及发病甜瓜的根、根际土、藤蔓及果实。西州蜜17号和黄86样品分别于2021年7月19～29日采自淖毛湖开发区路东四条田(43°46′N，94°55′E，海拔383 m)，共计采集样品13份。

选择典型发病植株将根挖出，敲掉根须上的土块；去除表层杂物，采集根际0～30 cm以内深度土样；剪取具有明显病斑的藤蔓；切下果实明显发病部位，分别放入样品袋中并立即于4℃保存。健康样品按同样方法取样。

1.1.2 试剂及仪器

供试试剂为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(含氯霉素)，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氢氧化钠、氯化钠，天津市北联精细化学品开发有限公司；酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；Tris、 Agarose，美国GENVIEW公司；冰乙酸，西安化学试剂厂；乙二胺四乙酸二钠，天津市福晨化学试剂厂；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

供试仪器为SW-CJ-2D型超净工作台，浙江孚夏医疗科技有限公司；H1650-W台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；AUW120型电子天平，日本岛津。

1.2 方 法

1.2.1 样品处理

1.2.1.1 组织样品

将各组织样品剪裁成小块后用去离子水将表面的杂质冲洗干净，并在滤纸上晾干；将晾干的组织块在超净台中用75%酒精浸泡1 min，超纯水冲洗后于无菌水中漂洗，控干组织表面无菌水；将组织块置于无菌研钵中，研磨至组织松散后转移至无菌50 mL离心管中，加入20 mL无菌水，摇匀并标记，存放于4℃。

1.2.1.2 土壤样品

将土壤中石块、根须等杂质去除后称取0.4 g土样，放入装有40 mL 0.8%无菌生理盐水的100 mL三角瓶中(含3颗无菌玻璃珠)，在25℃、180 r/min摇床上振摇30 min。

1.2.2 病原微生物分离、纯化培养

吸取1 mL的样品溶液加入于9 mL无菌生理盐水试管中，摇匀，逐级稀释并分别涂布于PDA及LB平板上，于25及37℃黑暗培养。待分离物长出后，挑取菌落形态不一样的单菌落，在PDA及LB平板上采用划线法分离培养微生物，将纯化菌株在4℃下保存于PDA及LB斜面。

1.2.3 DNA提取与基因序列扩增

将PDA培养平板上的菌丝刮下于液氮研磨，使用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌丝DNA，细菌采用细菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA提取。真菌选用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，细菌则选用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTG-3')进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25 μL：DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×MasterMix 12.5 μL，加 dd H2O 补足至 25 μL。细菌反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min；真菌反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共34个循环，最后72℃延伸10 min。

取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测得的基因序列在NCBI 数据库中进行 BLAST序列比对，确定微生物分类地位。

2 结果与分析

2.1 甜瓜黄86膨大期菌种分离及鉴定

研究表明，可培养菌株8株，其中细菌4株，真菌4株。从根部分离细菌2株，假单胞菌属(Pseudomonasvranovensis)及不动杆菌属(Acinetobactercalcoaceticus)各1株；真菌2株，织球壳属(Plectosphaerellacucumerina)及毛束霉属(Trichurusspiralis)各1株。从藤蔓分离细菌2株，假单胞菌属(Pseudomonashibiscicola)及肠杆菌属(Enterobactercloacae)各1株；真菌2株，Vishniacozyma属(Vishniacozymavictoriae)及根菌属(Talaromycesradicus)各1株。

得到可培养菌株15株，细菌9株，真菌6株。从根部分离细菌4株，不动杆菌属(Acinetobactercalcoaceticus)、假单胞菌属(Pseudomonasbrassicacearum)、泛菌属(Pantoeaagglomerans)及Peribacillus属(Peribacillussimplex)各1株；真菌4株，分别为轮枝菌属(Verticilliumdahliae)、刺盘孢菌属(Colletotrichumpisi)、球二孢属(Lasiodiplodiatheobromae)及镰刀菌属(Fusariumoxysporum)各1株。从藤蔓分离细菌6株，假单胞菌属(Pseudomonasbaetica、Pseudomonasfluorescens)、芽孢杆菌属(Bacillusaltitudinis、Bacillussubtilis)各2株，泛菌属(Pantoeaagglomerans)及类芽孢杆菌属(Paenibacillustundrae)各1株；真菌2株，毛束霉属(Trichurusspiralis)及Vishniacozyma属(Vishniacozymatephrensis)各1株。表1

表1 甜瓜黄86膨大期样品菌种分离、鉴定Table 1 Strain isolation and identification of muskmelon Yellow no. 86 samples during expansion stage

2.2 甜瓜西州蜜17号膨大期菌种分离及初步鉴定

研究表明，得到可培养菌株24株，细菌17株，真菌7株。从根分离部细菌5株，其中肠杆菌属2株(Enterobactercancerogenus、Enterobactersoli)，拉乌尔菌属(Raoultellaterrigena)、假单胞菌属1株(Pseudomonasfluorescens)及泛菌属(Pantoeaagglomerans)各1株；真菌2株，各枝孢属(Cladosporiumsinuosum、Cladosporiumherbarum)。从藤蔓分离细菌5株，其中芽孢杆菌属2株(Bacillussubtilis、Bacillusamyloliquefaciens)，肠杆菌属(Enterobactercloacae)、假单胞菌属1株(Pseudomonashibiscicola)及微小杆菌属(Exiguobacteriumundae)各1株。从果实分离细菌3株，其中肠杆菌属2株(Enterobacterhormaechei、Enterobactersoli)，芽孢杆菌属1株(Bacillusamyloliquefaciens)。从土样分离细菌7株，其中芽孢杆菌属3株(Bacilluscereus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluszhangzhouensis)，Mesobacillus属(Mesobacillussubterraneus)、假单胞菌属(Pseudomonasalcaligenes)、微小杆菌属(Exiguobacteriumacetylicum)及Peribacillus属(Peribacillusbutanolivorans)各1株；真菌5株，其中镰刀菌属2株(Fusariumfalciforme、Fusariumchlamydosporum)，曲霉属(Aspergillusnidulans)、链格孢属(Alternariaalternata)及环带状枝顶孢(Acremoniumsclerotigenum)各1株。

得到可培养菌株27株，细菌20株，真菌7株。从根部分离细菌3株，肠杆菌属(Enterobacterludwigii)、假单胞菌属(Pseudomonasputida)、亚特兰大杆菌属(Atlantibacterhermannii)各1株；真菌2株，各镰刀菌属(Fusariumsolani、Fusariumhaematococcum)。从藤蔓分离细菌3株，其中肠杆菌属(Enterobactercloacae)、肠球菌属(Enterococcuscasseliflavus)及克雷伯氏菌属(Klebsiellaoxytoca)各1株；真菌1株，为枝孢属(Cladosporiumcladosporioides)。从果实分离细菌3株，其中肠杆菌属(Enterobacterhormaechei)、芽孢杆菌属(Bacillussiamensis)及乳球菌属(Lactococcuslactis)各1株。从土样分离细菌11株，其中芽孢杆菌属4株(Bacillussubtilis、Bacillusvelezensis、Bacillusatrophaeus、Bacilluspumilus)，Priestia属2株(Priestiamegaterium、Priestiaaryabhatta)，假单胞菌属(Pseudomonasmendocina)、短杆菌属(Brevibacteriumfrigoritolerans)、中华根瘤菌属(Sinorhizobiummeliloti)、Rossellomorea属(Rossellomoreavietnamensis)及假黄色单胞菌属(Pseudoxanthomonaskoreensis)各1株；真菌4株，其中曲霉属2株(Aspergillusniger、Aspergillussydowii)，枝孢属(Cladosporiumfusiform)及环带状枝顶孢(Acremoniumzonatum)各1株。图1

注：a：甜瓜西州蜜17号根部样品可培养菌株分离鉴定图；b：甜瓜西州蜜17号蔓部样品可培养菌株分离鉴定图；c：甜瓜西州蜜17号果实样品可培养菌株分离鉴定图；d：甜瓜西州蜜17号根际土样品可培养菌株分离鉴定图

2.3 甜瓜黄86膨大期潜在病原微生物

研究表明，潜在病原微生物共计约4株，其中细菌1株，真菌3株。成团泛菌(Pantoeaagglomerans)为细菌性病害，可侵染多种植物，如玉米、杨树、核桃、棉花、火龙果、核桃等的腐烂病、黑斑病等。表2

表2 甜瓜黄86膨大期甜瓜样品病原菌及相关关联病害Table 2 Correlation list of pathogenic bacteria and related diseases of muskmelon huang 86 at expanding stage

2.4 甜瓜西州蜜17号膨大期潜在病原微生物

研究表明，潜在病原微生物共计约4株，其中细菌1株，真菌3株。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)可引起鹰嘴桃腐烂病，表3

表3 甜瓜西州蜜17号膨大期甜瓜样品病原菌及相关关联病害Table 3 Association list of pathogenic bacteria and related diseases of melon samples during the expansion period of Melon Honey west

3 讨 论

冷害会加速哈密瓜果肉硬度下降，这与刘同业等[3]研究结果一致，佘小漫等[11]采用常规病组织分离法获得2株可培养菌株鉴定为成团泛菌，经致病性测定该细菌可引起冬枣叶片产生枯死症状；尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)可引起甜瓜枯萎病，黄文枫等[12]从患病薄皮甜瓜茎组织分离的尖孢镰刀菌经过凯氏验证该病原菌为引起甜瓜枯萎病的致病菌；可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)为真菌性病原菌，可侵染多种作物，主要造成植株梢枯、枝枯、根腐、果腐、叶斑、溃疡、流胶、变色、坏死等，石金巧等[13]以猕猴桃叶斑病典型症状叶片为试材确定引起猕猴桃叶斑病致病病原为可可毛色二孢菌；大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)可引起甜瓜黄萎病，何苏琴等[14]通过对发病甜瓜采用组织分离法确定致病菌为大丽轮枝菌。

陈少先等[15]通过对采后鹰嘴桃病果病原菌分离鉴定，发现可培养菌株贝莱斯芽孢杆菌ZK1的致病能力最强，是桃类果实的病原菌；枝状枝孢霉菌(Cladosporiumcladosporioides)可引起香蕉煤污病，杨迪等[16]通过对广西香蕉上新发生煤污病的病原及其生物学特性研究，发现枝状枝孢霉为广西香蕉煤污病的病原菌；腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)可引起甜瓜镰孢根腐病，耿丽华等[17]通过对甜瓜设施栽培和露地栽培中甜瓜镰孢根腐病的研究确定了病原菌为腐皮镰孢菌；黑曲霉菌(Aspergillusniger)可引起鹰嘴桃腐烂病，陈少先等[15]通过对采后鹰嘴桃病果病原菌进行分离鉴定，发现黑曲霉亦为桃类果实的病原菌。

陈存坤[18]对甜瓜采后病害进行了分离鉴定，确认了甜瓜金凤凰主要致病菌为链格孢菌属、镰孢属及青霉属；相似的研究方法还应用在平菇[19]、核桃[20]和花椒[21]等作物的微生物病害研究中，发现了大量的病原菌和主要病害发生情况。

目前对哈密淖毛湖地区的甜瓜病原微生物的研究尚属空白，研究通过采集哈密地区主栽甜瓜品种西州蜜17号和黄86(八六王)的膨大期健康及发病甜瓜的根、根际土、藤蔓及果实，共计13份，经分离、培养及初步鉴定在甜瓜品种黄86健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株23株，其中细菌13株，真菌10株，发现主要病原菌2株，为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)可分别引起甜瓜枯萎病、黄萎病；甜瓜品种西州蜜健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株51株，其中细菌37株，真菌14株，发现主要病原菌1株，为腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)，可引起甜瓜镰孢根腐病。

4 结 论

在甜瓜品种黄86健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株23株，其中细菌13株，真菌10株，潜在病原菌4株，其中主要病原菌2株，为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)可分别引起甜瓜枯萎病、黄萎病；甜瓜品种西州蜜健康株及病株中共计分离、培养鉴定可培养菌株51株，其中细菌37株，真菌14株，潜在病原菌4株，主要病原菌1株，为腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)，可引起甜瓜镰孢根腐病。