秸秆还田对棉田土壤养分和微生物多样性的影响

秦新政，王玉苗，王志慧，谢成娟，王 博

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091；2.新疆师范大学生命科学学院，乌鲁木齐 830054)

0 引 言

【研究意义】秸秆是一种天然可再生资源[1]，富含氮、磷、钾等营养元素。随着农业的发展，农作物秸秆数量增长迅速[2-3]，秸秆若被遗弃和焚烧，会造成环境污染和资源浪费[4-5]。秸秆还田可以避免资源浪费和环境污染[6]，也可以增加土壤养分[7]、调整土壤微生物群落结构，能提高土壤质量[8-9]，也是发展可持续农业的有效途径[10]。秸秆还田形式多样，包括粉碎后直接翻压还田、覆盖还田、堆沤还田和腐熟剂处理还田等，其中，秸秆粉碎后直接翻压还田是当前秸秆肥料化利用的主要方式[11]。土壤微生物是土壤生态系统中极其重要和最为活跃的部分[12]，在土壤有机质形成和转化、土壤养分循环等方面发挥重要作用[13-14]。土壤微生物群落组成及活性变化是衡量土壤质量和肥力的一个关键性指标[15]。研究秸秆还田方式下土壤微生物多样性及群落结构演替规律，为秸秆资源有效利用提供理论依据，对改善土壤生态功能具有重要意义。【前人研究进展】棉秆中木质素含量较高，结构致密，还田后不易腐烂分解为土壤养分[16-18]。目前秸秆还田对农田土壤的影响已有很多研究结果，主要集中在秸秆还田对土壤的理化性质、酶活性、微生物群落结构变化以及农作物产量影响上。棉秆还田能够提高沿海盐碱地土壤养分，增加了土壤全氮、硝态氮、速效钾含量[19]。【本研究切入点】秸秆还田是减少棉花废弃物对环境污染的农业生产措施。目前秸秆直接还田对棉田土壤养分的深入研究报道较少。通过对棉秆还田后的降解、还田前后的土壤理化性质、可培养微生物数量和微生物多样性。需要研究还田后棉花秸秆的降解及对土壤养分与微生物多样性的影响。【拟解决的关键问题】以棉花秸秆粉碎还田后的土壤养分和土壤微生物为研究对象，分析棉花秸秆还田对棉田土壤养分和微生物多样性的影响，为棉花秸秆还田在降低农业环境污染和提升土壤肥力方面提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验位于新疆农业科学院综合试验场(E：87.4643，N：43.9448)，研究区属中温带大陆性干旱气候，年平均降水量不足200 mm，年气温7.3℃，试验点前茬作物为棉花。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

2020年开始试验采用秸秆还田方式，共设置2个处理：传统耕作(秸秆不还田+常规种植作为对照CK)，秸秆粉碎还田(CS)；将同一处理20袋秸秆样品(25×35) cm，孔径1 mm，每袋秸秆重量30 g左右，分成5组，每组4袋用细绳拴在一起。将5组样品按5点梅花形均匀埋置于小区(5 m×5 m)，深度5～15 cm，均匀散开袋中秸秆，还田实验期间未进行施肥及其他田间管理。棉花种植品种为棉双丰500 NH12026。

1.2.2 样品采集

土壤样品：于2020年11月初棉花收获后，2021年4月底棉花播种前，在处理样地内随机取样。每个处理设5个土壤采样点，去除土壤表层植株，采集0～20 cm土壤样品，用无菌袋收集。将每个处理的样品除去土壤中的根系、碎石及其他杂物，充分混匀后分成3份。土壤样本采用干冰冻存，寄送上海美吉生物医药科技有限公司测序。用于土壤微生物量测定的样品4℃保存，风干样品用于测定土壤理化性质。

棉秆样品：2020年11月初还田后采集对照棉秆样品，并于120、160和180 d采集还田腐解后的棉秆样品。

1.2.3 棉秆降解率

参照文献[20]方法，将还田实验所用的尼龙袋中的秸秆取出，冲洗干净，80℃烘干至恒重。秸秆失重率以质量分数计，按式(1)计算每袋样品的秸秆失重率：

Wx=(No-Nx)×100/No.

(1)

式中：

No：腐解前秸秆干重，g；

Nx：某腐解时间秸秆干重，g。

取5次测定结果的算术平均值作为测定结果，结果保留到小数点后2位。

1.2.4 土壤理化性质

参照文献中的土壤检测方法[21]测定土壤有机质、全氮、速效氮、速效钾、速效磷、水溶性盐总量、pH。

1.2.5 土壤微生物数量

对照土壤(CK)与还田处理土壤(CS)微生物菌落计数。称取3 g土样置于装有30 mL无菌生理盐水的三角瓶中，在摇床上以240 r/min，振荡30 min后静置3 min；将土样混悬液用无菌生理盐水逐级稀释，将稀释液分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板、马丁培养基平板、高氏一号培养基平板；细菌培养条件为37℃，培养48 h；真菌培养条件为25℃，培养6 d；放线菌培养条件为28℃，培养5 d；记录不同类型培养基中观察到的细菌、真菌、放线菌的菌落数量。

1.2.6 高通量测序

取0.5 g土样，采用SPINeasy DNA Kit for Soi，MP Biomedicais DNA提取试剂盒(12888)提取土壤DNA。将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。采用细菌V3-V4区扩增引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) /907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，真菌ITS1区段扩增引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR采用25 μL反应体系：含10倍PCR buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL (250 U)，DNA模板1 μL，ddH2O补齐至25 μL。PCR反应条件：98℃预变性3 min，98℃15 s，50℃30 s和72℃30s，分别进行25个(细菌)和35个(真菌)循环，最后在72℃下延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海美吉生物医药科技有限公司，在Illumina MiSeq测序平台上进行高通量测序分析。获得原始序列后进行质量控制，之后在97%序列相似性水平上聚类成可操作的分类单元(Operational Taxonomic Units， OTUs)。对照RDP和UNITE数据库进行分类注释，获取对应的细菌和真菌分类学信息。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS25.0对数据进行整理分析，方差分析采用最小显著差异法(LSD)多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同还田时间下棉秸秆降解程度变化

研究表明，棉花秸秆的降解率随着还田天数的增加而上升，处理180 d后，降解率最大可达5.01%。

秸秆还田后土壤速效氮、速效钾含量显著升高。秸秆还田前速效氮平均值为113.10 mg/kg，秸秆还田后速效氮平均值为121.48 mg/kg，提升了7.4%。秸秆还田前速效钾的平均值为308.00 mg/kg，秸秆还田后速效钾的平均值为408.93 mg/kg，提升了32.77%。表2

表1 不同还田时间下棉花秸秆降解程度变化Table 1 Change of degradation degree of cotton straw under different returning time

表2 不同秸秆还田下棉田土壤养分变化Table 2 Changes of soil nutrients in cotton field under different straw returning

2.2 秸秆还田对微生物数量的影响

研究表明，棉田土壤中可培养微生物总量提高9.8%，其中细菌数量提高64.6%，放线菌数量提高39.3%。表3

表3 不同秸秆还田下土壤主要微生物群落数量变化Table 3 Changes of soil microbial community quantity under different straw returning

2.3 秸秆还田对土壤微生物多样性的影响

研究表明，秸秆还田后真菌的Chao1、Ace、Simpson指数降低，多样性下降；而细菌的Chao1、Ace、Simpson指数升高，多样性上升。表4，表5

表4 不同秸秆还田下土壤真菌多样性变化Table 4 Diversity of soil fungi under different straw returning

表5 不同秸秆还田下土壤细菌群落多样性变化Table 5 Changes of soil bacterial diversity under different straw returning

2.4 秸秆还田对土壤真菌群落组成的影响

2.4.1 土壤真菌TOP10 科群落结构对比

研究表明，秸秆还田处理后真菌群落在科水平上菌种类型有显著变化，麦角菌科(Clavicipitaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)、粉褶菌科(Entolomataceae)、葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)代替格孢菌科(Pleosporaceae)、沙漠壳菌科(Eremomycetaceae)、粪壳菌科(Hypocreales)、盘菌科(Helotiales)成为秸秆还田后的土壤真菌优势菌群。其中秸秆还田后枝孢霉科(Cladosporiaceae)、赤壳科(Nectriaceae)、盘菌科(Helotiales)的相对丰度降低了48%、11%、10%；麦角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)的相对丰度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物种可能与植物形成共生关系，这对改善土壤的结构性质、促进植物的生长起一定的作用，毛壳菌科中的生防菌可能对植物病原菌具有抑制效果。图1

注：CK为对照处理；CS为秸秆还田处理；下图相同。横坐标/纵坐标为样本名，纵坐标/横坐标为物种在该样本中所占的比例，不同颜色的柱子代表不同的物种，柱子的长短代表该物种所占比例的大小，下同

2.4.2 土壤真菌TOP10 属群落结构对比

研究表明，秸秆还田土样与对照土样在真菌属群落构成类型有显著变化，优势菌属差异较大，绿僵菌菌属(Metarhizium)、毛壳菌属(Chaetomium)、粉红粘帚霉属(Clonostachys)、金孢子菌属(Chrysosporium)、刺盘孢属(Chordomyces)代替链格孢属(Alternaria)、假埃希氏菌属(Pseudallescheria)、匍柄霉属(Stemphylium)、异茎点霉属(Paraphoma)、粉红螺旋聚孢霉属(Clonostachys)成为秸秆还田后的土壤真菌优势菌属。其中被孢霉属(Mortierella)、绿僵菌菌属(Metarhizium)相对丰度提高了26%、29%，变化最为显著，这与真菌科水平上的变化相对应。图2

图2 秸秆还田土壤真菌属水平群落组成Fig.2 Community composition of Genus level of fungi in straw returning soil

2.4.3 土壤真菌TOP10 种群落结构对比

研究表明，对照土样在种水平上最优势的10个种分别是皱枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黄萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、枝细枝孢菌(Cladosporiumramotenellum)、拉长被孢霉(Mortierellaelongata)、喜马拉雅山维希尼克氏酵母(Vishniacozymaheimaeyensis)、紧密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)、小囊菌(Microascusbrevicaulis)和Chordomycesantarcticus；

秸秆还田土样在种水平上最优势的10个种分别是南极被孢霉(Mortierellaantarctica)、粪生毛壳菌(Chaetomiumtruncatulum)、裂叶金孢霉(Chrysosporiumlobatum)、小孢拟棘壳孢(Pyrenochaetopsisdecipiens)、Cadophoramalorum、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黄萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、拉长被孢霉(Mortierellaelongata)、Chordomycesantarcticus。对照土样与秸秆还田土样在真菌种水平群落组成表现出极明显差异。其中南极被孢霉(Mortierellaantarctica)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)都属于被枝孢霉属，秸秆还田后相对丰度提高了17%、33%；皱枝孢菌(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)相对丰度分别降低了72%、13%，其它种类在还田前后变化差异不大。图3

图3 秸秆还田土壤真菌种水平群落组成Fig.3 Community composition of Species level of fungi in straw returning soil

2.5 秸秆还田对土壤细菌群落组成的影响

2.5.1 土壤细菌TOP10 科群落结构对比

研究表明，秸秆还田前后土壤细菌科群落结构中TOP10占总序列的百分比分别为20%、22.1%，并用相对含量作堆积图。对照土样与秸秆还田土样在细菌科群落构成上类型有一定变化，芽孢杆菌科(Bacillaceae)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、除硫单胞菌科(Desulfuromonadaceae)仍是优势菌群，但芽孢杆菌科(Bacillaceae)与除硫单胞菌科(Desulfuromonadaceae)的相对丰度分别提高了6%、3%。秸秆还田后细菌科水平前10中新增加了盐厌氧菌科(Halanaerobiaceae)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)，相对丰度分别为14%、8%、4%。秸秆还田后的新增加的硝化螺旋菌科对于氮素循环起着重要作用。图4

图4 秸秆还田土壤细菌科群落组成Fig.4 Community composition of Family level of bacteria in straw returning soil

2.5.2 土壤细菌TOP10 属群落结构对比

研究表明，对照土样与秸秆还田土样在细菌属群落构成类型有所差异，盐胞菌属(Halocella)、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、半角藻属(Haliangium)、链霉菌属(Streptomyces)、梭状杆菌属(Clostridium)代替德沃斯氏菌属(Devosia)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、嗜盐囊菌属(Haliangium)、马赛菌属(Massilia)、固氮弓菌属(Azoarcus)成为秸秆还田后的土壤细菌优势菌属。秸秆还田后芽孢杆菌属仍是优势菌属，相对丰度增加了3%，盐胞菌属(Halocella)、盐厌氧菌属(Halanaerobium)、半角藻属(Haliangium)、链霉菌属(Streptomyces)、梭状杆菌属(Clostridium)为新增加的前10菌属，相对丰度分别为12%、10%、4%、4%、2%。图5

图5 秸秆还田土壤细菌属群落组成Fig.5 Community composition of Genus level of bacteria in straw returning soil

2.5.3 土壤细菌TOP10 种群落结构对比

研究表明，对照土样与秸秆还田土样在细菌种群落构成上类型有所差异，农研所芽孢杆菌(Bacillusniabensis)、碱性杆菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢杆菌(Bacillusselenatarsenatis)、痤疮丙酸杆菌(Halocellacellulosilytica)、产蛋白酶中度嗜盐菌(Thalassobacillusdevorans)代替黏着剑菌(ensiferadhaerens)、地中海短波单胞菌(Brevundimonasmediterranea)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、米苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、柯奈尼亚小单胞菌(Micromonosporachokoriensis)成为秸秆还田后的土壤细菌优势菌属。农研所芽孢杆菌(Bacillusniabensis)、碱性芽孢杆菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢杆菌(Bacillusselenatarsenatis)为秸秆还田后新增加的前10优势菌种，相对丰度分别为16%、12%、11%。图6

图6 秸秆还田土壤细菌种水平群落组成Fig.6 Community composition of Species level of bacteria in straw returning soil

3 讨 论

将秸秆直接粉碎回田仍是高效、直接且容易实现的方法[19]。研究测量了棉花秸秆在粉碎还田后的降解率，棉花秸秆的降解随着还田天数的增加而上升，降解率最大可达5.01%。

在对盐碱地进行棉秆还田的研究表明，还田显著增加了0～20 cm土层各时期的全氮含量，不同秸秆还田方式均能改善土壤理化性质[21]。研究通过测定土壤理化性质对比发现，秸秆还田后土壤速效氮和速效钾含量显著增加，分别提高7.40%和32.77%。有研究发现，秸秆施加后会显著增加水稻土壤速效钾的含量[14]。

不同秸秆还田方式可增加农田残茬、枯落物及植物根系分泌物，导致土壤碳、氮增加，土壤微生物可利用碳源增加，增加土壤微生物活性[25]，增强土壤微生物对碳水化合物、氨基酸、胺类化合物等碳源的利用能力[26]。秸秆还田配施有机肥与微生物有机肥能显著提高土壤微生物的数量与活性，微生物群落结构也随之发生变化，有利于土壤生态环境的改善，其中秸秆还田配施微生物有机肥效果最为显著[15]。复合菌剂加上常规化肥处理能够加速秸秆养分还田、改善土壤理化状况，增强微生物活性[25]。土壤微生物在秸秆降解和营养元素释放过程中起着关键作用，同时秸秆还田方式、还田数量也会对土壤微生物产生较大的影响。通过微生物群落碳源利用的主成分分析表明，秸秆层能有效滞留氮素，减少土壤氮素淋失，增加土壤微生物群落功能多样性[26]。

棉花秸杆还田使土壤中可培养微生物总量提高9.8%，细菌数量提高64.6%，放线菌数量提高39.3%；秸秆还田对土壤微生物多样性有显著影响，在科、属、种层面的微生物菌群结构都发生了变化。尤其是真菌的群落结构变化显著，麦角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)的相对丰度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物种可能与植物形成共生关系，对改善土壤的结构性质、促进植物的生长起一定的作用，毛壳菌科中的生防菌可能对植物病原菌具有抑制效果。其中被孢霉属(Mortierella)、绿僵菌菌属(Metarhizium)相对丰度提高了26%、29%，变化最为显著，与真菌科水平上的变化相对应。绿僵菌菌属为麦角菌科，是一类重要的生防真菌，可寄生多种昆虫，在生产中已得到广泛的应用。

4 结 论

秸秆还田能够增加棉田土壤养分和可培养微生物的数量，秸秆还田后土壤速效氮和速效钾含量显著增加，分别提高7.40%和32.77%；土壤可培养微生物总量提高9.8%，其中细菌数量提高64.6%，放线菌数量提高39.3%；秸秆还田对土壤微生物多样性有显著影响。