基于非靶向代谢组学的春闺与铁观音乌龙茶品质研究

余文权，李鑫磊，钟秋生，林郑和，单睿阳，陈志辉，陈常颂

（福建省农业科学院茶叶研究所 福州 350012）

乌龙茶是我国独有的一种茶类，起源于福建，有闽北、闽南、广东及台湾四大产区。近年来乌龙茶产业得到迅猛地发展，深受国内外消费者的喜爱。春闺【Camellia sinensis （L.） O.Kuntze】是从黄旦自然杂交后代中采用单株育种法育成的乌龙茶新品种（闽审茶2015001），属灌木型，小叶类，晚生种。春闺生长势较强，持嫩性较强，产量较高，抗性强。制乌龙茶，有特殊香气且浓郁持久，味醇、汤中有香[1]，区试点连续3年品质高于对照黄旦[2]。代谢组学技术是一种高效多靶点地研究小分子物质及其动态变化的技术[3]。代谢组学技术可分为靶向技术与非靶向技术。近年来，靶向与非靶向代谢组学技术联合广泛应用于茶叶代谢物发现和动态变化研究[4-5]。目前，尚未有针对春闺品种制得的乌龙茶品质特点的代谢组学研究。铁观音是闽南乌龙茶的最重要品种，成茶具有香高、持久等特点。本文采用春闺与铁观音鲜叶为原料，按照闽南乌龙茶工艺分别制成春闺与铁观音乌龙茶成茶。采用顶空固相微萃取结合全二维气相飞行时间质谱（HS-SPME/GC×GC-TOF-MS） 和超高效液相串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术分析春闺乌龙茶与铁观音乌龙茶之间挥发性与非挥发性代谢物差异，探明春闺品种制作乌龙茶的成茶特征及其形成机理，为进一步指导乌龙茶生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

春闺品种鲜叶 （CGX） 和铁观音品种鲜叶（TGYX）均于2017年5月采自福建省农业科学院茶叶研究所福安市社口镇茶园。液氮取样，冻干，待测。按照闽南乌龙茶工艺将上述茶树品种鲜叶分别制成春闺毛茶（CGM）和铁观音毛茶（TGYM），冻干、待测[6]，每个处理均取3 份作为技术重复。

色谱级乙腈、甲醇和甲酸，德国Merck 公司；无水乙醚，上海阿拉丁公司；表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、色氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、伽马氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）、亮氨酸、天门冬氨酸、苯丙氨酸、腺苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和牡荆素，美国Sigma 公司；去离子水，美国Millipore 公司。

1.2 试验仪器与设备

Pegasus 4D 全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC），美国LECO 公司；Agilent 7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪 （GC-MS）、Infinity 1290 超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）、C18 色谱柱 【Zorbax Eclipse Plus（150 mm×3.0 mm，1.8 μm）】，美国Agilent 公司；A11 多功能高速粉碎机，德国IKA 公司。

1.3 样品前处理

1.3.1 挥发性组分 2018年3～5月，在中国农业科学院茶叶研究所进行样品前处理。采用顶空固相微萃取法（HS-SPME）提取乌龙茶样品的香气成分。具体操作步骤：精确称取10 g 茶粉，加入15 μL 2 mg/mL 癸酸乙酯和100 mL 沸蒸馏水于450 r/min 条件下搅拌，放入烘箱中5 min，接着吸附40 min 后进行GC×GC-TOF-MS 及GC-MS 检测。每个样品做3 个生物学重复。

1.3.2 非挥发性组分 采用多功能高速粉碎机对上述茶样进行粉碎。称取每个茶叶样品0.3 g 于50 mL 离心管中，以45 mL 100 ℃蒸馏水浸提5 min，每隔1 min 对离心管上、下摇晃，然后用高速离心机（转速8 000 r/min）离心10 min，，取2 mL上清液，过0.22 μm 滤膜，基于UHPLC-Q-TOFMS 进行代谢组学分析。

1.4 分析条件

1.4.1 GC×GC-TOF-MS GC×GC 条件见表1。质谱：EI；电离能量：-70 eV；质量扫描范围：33～600 m/z；离子源温度：220 ℃。

表1 全二维色谱条件Table 1 Experiment conditions of GC×GC

1.4.2 UHPLC-Q-TOF-MS 流动相A 为0.1%甲酸-水，B 为甲醇；进样量2 μL。流速0.4 mL/min。柱温40 ℃。采用梯度洗脱方式：0～3.5 min，使用10%流动相B；3.5～5.5 min，使用15%流动相B；5.5～7 min，使用32%流动相B；7～12 min，使用55%流动相B；12～15.5 min，使用75%流动相B；15.5～18 min，使用95%流动相B；18～18.1 min，使用10%流动相B；18.1～23 min，使用10%流动相B。质谱：电喷雾离子化（ESI），扫描方式为正离子模式，毛细管电压3 500 V，干燥气温度300 ℃，流速8 L/min，雾化气压强241 kPa，鞘气温度300℃，流速11 L/min，质谱扫描范围100～1 000 m/z。

2 结果与分析

2.1 春闺和铁观音鲜叶及制成的闽南乌龙茶毛茶挥发性组分特征

茶叶中挥发性组分含量虽低，但对茶叶品质影响大，特别是乌龙茶。采用HS-SPME-GC×GCTOFMS 技术分析春闺和铁观音鲜叶以及制成的闽南乌龙茶毛茶的香气组分，结合质谱数据库匹配、化合物保留时间、结构谱图及峰面积等方法共鉴定出572 种挥发性代谢产物。对这些产物进行主成分分析，如图1所示：第1 主成分为53.9%，第2 主成分为18.5%，共计72.4%，包含样本的大部分挥发物信息。春闺和铁观音鲜叶及相应毛茶在挥发性组分方面表现出良好的分离度，鲜叶样本均位于第1 主成分负轴，毛茶样本均位于第1主成分正轴。

图1 春闺与铁观音挥发性组分主成分分析Fig.1 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

从主成分分析载荷图（图2）可以看出，根据坐标位置推测春闺鲜叶中代表性组分为香叶醇、芳樟醇、苯乙醇、α-蒎烯等，铁观音鲜叶中的代表性组分为乙酸叶醇酯、水杨酸甲酯、反式芳樟醇氧化物等。春闺和铁观音毛茶中的挥发性组分整体较接近，代表性物质为十一烷、十烷、吲哚、β-罗勒烯、苯乙醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇、茉莉内酯、脱氢芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯等。

图2 春闺与铁观音挥发性组分载荷图Fig.2 Loading plots of Chungui and Tieguanyin volatiles

2.2 春闺和铁观音鲜叶及其毛茶主要挥发性组分相对含量的差异

橙花叔醇、吲哚、法尼烯、β-罗勒烯、茉莉内酯、脱氢芳樟醇等为乌龙茶重要挥发性代谢产物，呈现特征花果香气[7-11]。图3显示春闺和铁观音鲜叶及其毛茶之间主要挥发性组分相对含量的差异。春闺鲜叶中相对含量最高的挥发物为香叶醇（9.28%），香叶醇和α-蒎烯含量显著高于铁观音鲜叶。铁观音鲜叶中相对含量最高的挥发物为乙酸叶醇酯（10.47%），铁观音鲜叶反式芳樟醇氧化物、脱氢芳樟醇和乙酸叶醇酯显著高于春闺鲜叶。

图3 春闺和铁观音乌龙茶中主要挥发性组分差异Fig.3 Differences of important volatile components in CG and TGY oolong tea

春闺毛茶中相对含量最高的化合物为吲哚（11.13%），吲哚在一定浓度条件下表现为茉莉花香，吲哚、茉莉内酯、1-辛烯-3-醇、α-法尼烯、β-罗勒烯、己酸叶醇酯等显著高于铁观音毛茶。铁观音毛茶中相对含量最高的化合物为吲哚（3.89%）和脱氢芳樟醇（3.84%），仅脱氢芳樟醇相对含量显著高于春闺毛茶。春闺毛茶和铁观音毛茶中6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花叔醇和苯甲醛含量无显著差异。

2.3 春闺和铁观音鲜叶及制成的闽南乌龙茶毛茶非挥发性组分特征

采用UHPLC-QTOF-MS 技术测定春闺和铁观音鲜叶及制成的闽南乌龙茶毛茶非挥发性代谢组分，共获得2 897 个化合物信号，对上述组分进行主成分分析。如图4所示，第1 主成分为25.9%，第2 主成分为23.1%，共计49%，包含样本一半左右的信息。样品间表现出良好的分离度，从第1 主成分看，春闺鲜叶与毛茶均位于第1 主成分正轴，铁观音鲜叶与毛茶均位于第1 主成分负轴，说明第1 主成分体现不同品种间的差异物质；从第2主成分看，春闺与铁观音鲜叶位于第2 主成分正轴，春闺与铁观音毛茶位于第2 主成分负轴，说明第2 主成分体现加工前、后的差异物质。对上述非挥发性代谢组分离子进行差异化合物筛选 【P<0.05、变量投影重要性 （VIP）>1、倍数变化（Fold Change）>1.5】和鉴定，共鉴定出33 种差异代谢产物，见表2。儿茶素与儿茶素二聚体8 种，黄酮醇或黄酮糖苷7 种，游离氨基酸组分12 种，酚酸2种，香气糖苷前体1 种，其它3 种。

图4 春闺与铁观音非挥发性组分主成分分析Fig.4 Principle component analysis plots of Chungui and Tieguanyin non-volatiles

表2 春闺乌龙茶与铁观音乌龙茶非挥发性差异代谢物Table 2 Differential non-volatile metabolites identified in CG oolong tea and TGY oolong tea

从图5主成分分析载荷图可看出，第1 主成分上，正轴分布全部黄酮醇或黄酮糖苷类组分、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、4-O-p-香豆酰奎宁酸和芳樟醇樱草糖苷等为春闺品种代表性组分；负轴分布全部儿茶素与儿茶素二聚体、γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、3-O-p-香豆酰奎宁酸、麻黄素、茶没食子素和茶碱等，为铁观音品种代表性组分。

图5 春闺与铁观音乌龙茶非挥发性组分载荷图Fig.5 Loading plots of non-volatiles components of Chungui and Tieguanyin oolong tea

2.4 春闺和铁观音鲜叶及其毛茶主要非挥发性组分相对含量差异分析

儿茶素是茶叶中最主要的次级代谢产物，占茶树鲜叶干重的12%～24%[12]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、ECG、表没食子儿茶素（EGC）和EC 为茶叶中主要的儿茶素组分。图6显示，差异儿茶素组分为C、EC、ECG、EGC、GC 和EGCG，二聚儿茶素组分为原矢车菊素B1 和原矢车菊素B3。由于春闺品种鲜叶的EC、ECG 和原矢车菊素B1 相对含量均显著低于铁观音鲜叶，因此其毛茶儿茶素组分均明显低于铁观音品种。

黄酮或黄酮醇糖苷类物质与儿茶素组分含有相同的前体，包括槲皮素、山柰酚、杨梅素及其相应糖苷。黄酮或黄酮醇糖苷类物质占茶树鲜叶的总酚类物质最高达13%左右[14]。图6显示，差异黄酮或黄酮醇糖苷组分为山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖基芸香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基芸香糖苷、芹菜素-6-阿拉伯糖-8-葡萄糖苷和芹菜素-6-葡萄糖-8-阿拉伯糖苷。黄酮或黄酮醇糖苷类物质无论在鲜叶还是毛茶中，春闺品种均明显高于铁观音品种。

茶叶中富含多种氨基酸，目前，从茶叶中共鉴定出的氨基酸类型有26 种，其中20 种为蛋白质氨基酸，6 种为非蛋白质氨基酸[13]。氨基酸组分是茶汤鲜甜滋味的来源和部分香气前体，图6显示，差异氨基酸组分为γ-氨基丁酸、谷氨酸、茶氨酸、茶氨酸葡萄糖苷、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和苏氨酸。春闺品种鲜叶中γ-氨基丁酸、谷氨酸和茶氨酸葡萄糖苷显著高于铁观音品种，仅色氨酸显著低于铁观音鲜叶。

酚酸是一类含有酚环的有机酸。图6显示，差异酚酸组分为3-O-p-香豆酰奎宁酸和4-O-p-香豆酰奎宁酸。春闺乌龙茶酚酸组分相对含量均显著低于铁观音乌龙茶。春闺品种鲜叶和毛茶中3-O-p-香豆酰奎宁酸显著低于铁观音品种，4-O-p-香豆酰奎宁酸显著高于铁观音品种。

图6显示，麻黄素和芳樟醇樱草糖苷在春闺与铁观音品种之间无显著差异，春闺品种鲜叶和毛茶的茶没食子素显著低于铁观音品种，茶碱在铁观音鲜叶中明显富集。

图6 从春闺与铁观音乌龙茶中鉴定出的物质丰度热图Fig.6 Heat map of components abundance identified from Chungui and Tieguanyin oolong tea

3 讨论

前人感官审评表明，用春闺品种制成的乌龙茶具有花香浓郁、持久的特点[1，6]。本研究发现，春闺乌龙茶挥发性香气组分整体与铁观音乌龙茶相近，且吲哚、橙花叔醇和茉莉内酯等乌龙茶特征性组分显著高于铁观音乌龙茶。吲哚是春闺乌龙茶相对含量最高的组分，由吲哚-3-磷酸甘油在色氨酸合成酶催化下形成，乌龙茶摇青工序引起色氨酸合成酶2 的β 亚基显著表达，吲哚积累，吲哚会进一步转化为色氨酸与氧化吲哚[16]。本研究显示，吲哚的次级代谢物色氨酸含量显著低于铁观音品种，可能与春闺品种中控制吲哚转化为色氨酸相应酶类基因表达不高，引起吲哚大量积累有关，结果还需进一步验证。另外，橙花叔醇和茉莉内酯在机械力、低温等多种胁迫条件下高表达，由法呢基焦磷酸形成橙花叔醇[17]，茉莉内酯由α-亚麻酸与亚油酸在茶树脂氧合酶1 作用下转化而来[18]，因在春闺品种中，上述挥发性组分前体或相应基因的高表达而积累，其机理有待探究。

春闺品种制成的乌龙茶具有滋味醇爽的特点[1]。本研究表明，与铁观音品种制成的乌龙茶相比，春闺品种鲜叶和毛茶中大部分儿茶素单体和二聚体低于铁观音品种，而黄酮醇或黄酮糖苷类物质明显富集，儿茶素组分与黄酮醇或黄酮糖苷类物质具有共同前体，因此，春闺品种中，前体可能更多地转化为黄酮醇或黄酮糖苷类物质，使儿茶素组分含量降低。儿茶素组分在茶汤中表现为苦味，黄酮醇或黄酮糖苷的涩味阈值较低[19]，表现为涩味，构成春闺品种的醇爽滋味。