欧姆加热和转谷氨酰胺酶对猪肉糜制品品质特性的影响

戴妍，卢忆，邬威2,，高晓光3,，张静，戴瑞彤*

1. 重庆化工职业学院环境与质量检测学院（重庆 401228）；2. 西南大学动物科学技术学院（重庆 400715）；3. 河北科技大学生物科学与工程学院（石家庄 050000）；4. 中国农业大学食品科学与营养工程学院（北京 100083）

近年来，随着消费人群对健康食品和高质量食品的认识明显提高，越来越多的消费者追求高品质食品。如何在提升食品营养健康水平的前提下改良食品品质成为研究热点。在肉品研发领域，如何生产出更为健康、低成本、环境友好的肉制品以满足市场需要，一直以来也是研究热点之一，越来越多的研究涉及以肉糜为基础，辅以淀粉、蛋清、卡拉胶、褐藻胶、酶制剂等黏合剂的低盐/减盐重组肉制品方向[1-2]。

有很多酶体系（多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶）主要用于固定食品中蛋白质系统，它们通过在食品体系中蛋白质分子之间形成共价键，通过粘合食品成分，促进蛋白质-蛋白质凝胶的形成，从而生产出较好质构特点的产品。谷氨酰胺转移酶（transglutaminases，TG）在提高肉制品质构方面的应用最为广泛[3]。即使食品中食盐量较低，通过添加一定量的蛋白酶催化肉制品内部的交联反应，提升内部成分联结，从而形成较好的质构特点。外源性微生物谷氨酰胺转移酶（microbial transglutaminase，MTGase）属于谷氨酰胺转移酶的一种，可以催化肌动球蛋白、明胶和胶原蛋白中ε-（γ-glutamyl）-lysine共价键的形成[4-5]，而且它可以作为很强的黏合剂，在加工过程中可以显著增强肉品的弹性、硬度和强度[5]，而添加蛋清（egg white）、魔芋粉（konjac flour，KF）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidases，PPO）、漆酶（laccases）、酪氨酸酶（tyrosinase）等也有助于提高蛋白质-蛋白质间相互作用，促进肉制品良好品质形成[3]。

欧姆加热是一种新型快捷的电极加热方式，主要通过诱导食物自身导电达到加热的目的。欧姆加热比传统加热食品有诸多优点，如有更好的感官特性和食用品质等[6-8]。前人研究表明，快速欧姆加热方式显著提高鱼糜凝胶保水性能[9]。同时使用欧姆加热和谷氨酰胺转移酶（0.5% TG酶）处理制备猪肉糜制品方向的研究国内外还是空白，通过对比水浴加热，探明欧姆加热法制备的猪肉糜制品特点，由于欧姆加热本身对于肉中蛋白质变性程度并不比水浴加热高，对于肉糜制品质构（凝胶）形成可能没有太大优势，此次试验通过考虑加入谷氨酰胺转移酶，考察能否通过欧姆加热这种快速加热的方式达到与通常水浴加热肉糜制品同样的效果，从而提升肉糜制品加工效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜猪肉背最长肌（市售，剔去可见脂肪，放入搅碎机搅碎，每次试验所需肉量由试验处理组的数量决定，共做4次重复性试验）；鸡蛋白粉（食品级，北京九州天瑞科技有限公司）；鲜蛋黄液（北京德青源公司）；谷氨酰胺转移酶（食品级，江苏锐阳生物科技有限公司）；多聚磷酸盐（食品级，青岛菲利特食品配料有限公司）；KCl、NaCl、MgCl2、酒石酸钾钠、CuSO4、NaOH等（国产分析纯试剂）；蛋白酶抑制剂PMSF（Amresco公司）；5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、SDS和牛血清白蛋白等（生化试剂，北京索来宝有限公司）。

1.2 仪器与设备

实验室自制欧姆加热设备，主要由交流电源、支架箱、加热单元、电流传感器、DHC8P电压表、DPH8P电流表、热电偶温度计等组成[10]，其中加热单元设计为内径4.2 cm、长度16 cm；调和机（德国博朗）；DK-8B电热恒温水槽（上海精密实验设备有限公司）；CR-400色差计（日本美能达公司）；Evolution60紫外可见分光光度计（美国热电公司）；TA-XT2质构仪（英国Stable Micro Systems公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell system蛋白电泳仪（美国Biorad公司）；凯氏定氮仪（德国Foss公司）；S-3400N扫描电镜（日本Hitachi公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 猪肉糜制品制备过程

准备1 000 g新鲜猪肉糜，依次加入0.3%三聚磷酸盐、10%鲜蛋黄液、10%脱水蛋白粉及30%冰水，添加TG酶处理组肉糜还需要将0.5% TG酶混合在肉糜中，置于调和机混合（中低速档位），肉糜中心温度不超过15 ℃，分别取400 g混合好的猪肉糜用于欧姆加热和水浴加热。

欧姆加热（不添加TG酶）：交流电源（50 Hz、3.5 kW）、电压梯度（9 V/cm）对猪肉糜进行加热，猪肉糜制品的最冷温度＞95 ℃时，立即关闭电源后取出冷却至室温。

水浴加热（不添加TG酶）：将混合好的肉糜灌入塑料肠衣（内径4.2 cm、长度16 cm）中，将肉糜带着肠衣直接放入水浴加热槽子（100±2 ℃）进行加热，猪肉糜制品最冷温度＞95 ℃时，立即关闭电源后取出冷却至室温。

欧姆加热（添加TG酶）：将肉糜采用欧姆加热到中心温度（37±2 ℃），立即关闭电源，保温30 min后再加热，猪肉糜制品最冷温度＞95 ℃时，立即关闭电源后取出冷却至室温。

水浴加热（添加TG酶）：将肉糜灌入塑料肠衣后，放入水浴槽子进行加热，肉糜中心温度达到37± 2 ℃，关闭电源，保温30 min后加热猪肉糜制品最冷温度＞95 ℃时，取出冷却至室温，将猪肉糜样品用于如下指标测定。

1.3.2 蒸煮率损失和压榨损失分析

根据参考文献[11-12]的方法，蒸煮率损失采用称重法测定，待样品加热冷却至室温后，用滤纸轻轻擦拭肉糜制品表面的水分后用天平称其质量。按照式（1）进行计算。压榨损失（expressible moisture）用离心法测定，肉样体积为1.5 cm×1.5 cm×2.5 cm，质量3.76±0.29 g，肉样用4层滤纸包裹后放置于50 mL离心管中。样品在4 ℃，用4 000×g离心40 min后称其质量，按式（2）进行计算。测定4个处理组猪肉糜样品的蒸煮率损失和压榨损失。

1.3.3 颜色分析

根据参考文献[9]的方法，分别切开4个处理组猪肉糜样品，在切面上随意选取4个点，用色差计测定色泽参数值（L*、a*、b*）。

1.3.4 质构分析

根据参考文献[9，13]的方法，将冷却好的4个处理组猪肉糜样品在室温下（25 ℃）冷却2 h后，测定其质构指标，将3～5块平行的样品（直径4 cm、高度2 cm）放在质构仪台面上，用直径为6 mm的金属圆形探刺头刺破样品（刺破深度1.5 cm，探头下降速度1 mm/s，每块样品刺3～6次），测试参数包括破碎力（g）和形变（cm）。

1.3.5 猪肉糜肌原纤维蛋白的提取及SDS-PAGE分析

根据参考文献[14]的方法，将2 g切碎的猪肉糜样品加入到pH 6.5的20 mL肌纤维提取缓冲液（150 mmol/L氯化钠、25 mmol/L氯化钾、3 mmol/L氯化镁，4 mmol/L EDTANa2和1 mmol/L PMSF）中。按10000×g匀浆10 s，将样液离心（4 ℃，按5000×g离心30 min），含有肌原纤维蛋白沉淀物的样液用缓冲液（50 mmol/L氯化钾和5 mmol/Lβ-巯基乙醇）冲洗3遍，重复上述匀浆和离心过程。用此溶液提取沉淀，匀浆，得到的悬浊液为样品液肌原纤维蛋白的提取液。悬浊液的浓度用双缩脲法测定。将提取4个处理组猪肉糜样品的肌原纤维蛋白，采用SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度12.5%，浓缩胶浓度4%。蛋白样品按1∶1与样品缓冲液[含有8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、0.025 mol/L Tris（pH 6.8）、0.075 mol/L DTT、0.104 mol/L SDS和0.05%溴酚兰]混合。混合后的样品液用沸水加热5 min。取约20 μg肌原纤维蛋白液上样（采用蛋白marker作为对照）。凝胶用小型的Bio-Rad蛋白电泳仪做分离，采用恒流模式（30 mA）保持1.5 h后，取出凝胶，用考马斯亮蓝染液R-250（1 g/L）染色1 h后，用脱色液（120 mL/L甲醇和75 mL/L乙酸）隔夜脱色，脱色后的凝胶用凝胶成像仪拍照。

1.3.6 凝胶游离巯基含量分析

根据参考文献[15]的方法，利用5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）比色法测定4个处理组猪肉糜样品的游离巯基含量，将2.0 g肌肉加入50 mL pH8.0缓冲液（5.0% SDS，0.10 mol/L Tris）。匀浆后将样品液放入80 ℃水浴中加热30 min，离心（5000×g，20 min），滤液中的蛋白浓度用紫外可见分光光度计测定（280 nm）。样品液用缓冲液稀释至1.5 mg/mL，测试样品液将0.5 mL上述样品液、2.0 mL Tris缓冲液（0.10 mol/L、pH8）及0.50 mL的DTNB溶液（含有10 mmol/L DTNB，0.10 mol/L Tris，pH8）混合。空白样品液将5% SDS溶液0.50 mL，0.10 mol/L Tris缓冲液2.0 mL以及DTNB溶液0.50 mL混合后于412 nm比色，吸光系数用11400 L/（mol·cm）计算，总游离巯基含量的结果表示为nmol/mg。

1.3.7 凝胶扫描电镜分析

将4个处理组的猪肉糜样品切成5 mm×5 mm×5 mm小块，用2.5%戊二醛溶液固定，0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸固定，依次使用30%，50%，70%，80%，90%和100%乙醇脱水后，干燥喷金后置于Hitachi S-3400N扫描电镜下观察[16]。

1.4 统计方法

用SPSS 16.0数据分析软件对各指标进行分析，ANOVA及Duncan法用于所有处理组各指标显著性差异（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 欧姆加热与水浴加热对猪肉糜样品的加热时间影响

在不加入TG酶的前提下，欧姆加热组和水浴加热组猪肉糜样品的加热时间分别为6±1 min和35±2 min。在加入TG酶后，欧姆加热组和水浴加热组猪肉糜样品的加热时间分别为37±2 min和67±1 min。欧姆加热肉糜制品所需时间为水浴加热处理组的1/6～1/2。

2.2 颜色变化分析

4个处理组猪肉糜样品的颜色变化分析如表1所示。在所有4个猪肉糜处理组样品中，亮度值（L*）与黄度值（b*）无显著性差异（p＞0.05），欧姆加热组肉糜样品（无TG酶）的a*（-0.50）显著低于（p＜0.05）水浴加热（无TG酶）组（0.60）。原因可能是此次试验欧姆加热肉糜制品的终点温度（95～120 ℃）比水浴加热的要高（95～100 ℃），造成猪肉糜样品a*的下降可能引起一定程度的褪色，可能与肉糜内部色素蛋白含量、肌原纤维蛋白降解或者氧化，以及蛋液差异等有一定关系[17]，但总体而言，欧姆加热与水浴加热肉制品颜色差异不大，苑善振等[18]也认为不同保温时间的欧姆加热与水浴加热组均在红度值a*和亮度值L*上无显著性差异（p＞0.05）。

表1 欧姆加热和水浴加热（添加或不添加TG酶）肉糜制品的颜色变化分析

2.3 蒸煮率、压榨损失及游离巯基含量分析

表2显示4个处理组猪肉糜样品蒸煮率损失、压榨损失及游离巯基含量分析。巯基的氧化可能导致食品内部二硫键形成，同时可能会加强肉制品内部组织交联，形成较为坚硬的组织结构[9]。总体来看，4个处理组猪肉糜样品的蒸煮率损失以及游离巯基含量无显著性差异（p＞0.05）。欧姆加热组猪肉糜样品（无TG酶）的压榨损失（20.06%）显著低于水浴加热处理组（无TG酶）的压榨损失（24.26%）（p＜0.05），但是当加入0.5% TG酶时，欧姆加热和水浴加热处理组的猪肉糜样品的压榨损失无显著性差异（p＞0.05）。压榨损失在一定程度上反映了肉的保水性变化，由于升温速率快，欧姆加热肉糜制品可能比水浴加热处理组含有更多的水分，也就是有较好的保水性能。Tadpitchayangkoon等[9]认为，无论有没有蛋清的加入，欧姆加热处理的鱼糜制品显示出更好的保水性能。Ngel-Rendón等[19]采用20 V/cm加热猪肉2～3 min，认为保水性与平底锅加热11 min保水性无显著性差异。试验结果总体与Tadpitchayangkoon等[9]和Ngel-Rendón等[19]的研究结论相似。

表2 欧姆加热和水浴加热（添加或不添加TG酶）肉糜制品的蒸煮率、压榨损失及巯基含量分析

2.4 质构分析

表3显示4个处理组猪肉糜制品质构参数分析。欧姆加热组（无TG酶）猪肉糜样品的破碎力、形变以及凝胶强度与水浴加热处理组（无TG酶）样品无显著性差异。欧姆加热处理组（0.5% TG酶）样品的破碎力（1 305.34 g）和凝胶强度（1 184.21 g·cm）显著高于（p＜0.05）欧姆和水浴处理组（无TG酶）（p＞ 0.05），欧姆加热处理组猪肉糜（0.5% TG酶）样品的破碎力（1 305 g）显著高于水浴加热处理组样品（1 166.54 g）（p＜0.05）。Dondero等[13]也认为加入0.5% TG酶的牛肉蛋白样品凝胶强度相比对照组提升了88%（p＜0.05）。Tadpitchayangkoon等[9]认为欧姆加热虽然加热速度快，但其蛋白质降解与解聚水平比较轻微，最终加热后的肉制品质构及凝胶水平可能弱于传统水浴加热处理组。范大明等[20]认为可能加热速率过快，蛋白质分子就没有足够的时间变性展开而影响其最终的聚集，而试验通过适当提高欧姆加热肉糜制品的终点温度范围，使欧姆加热与水浴加热后的猪肉糜凝胶强度水平相当。

表3 欧姆加热和水浴加热（添加或不添加TG酶）肉糜制品质构特点分析

2.5 电泳分析

图1显示的是4个处理组猪肉糜样品肌纤维蛋白SDS-PAGE分析。从图1可以看出，4个处理组猪肉糜蛋白条带整体差异不大，欧姆加热结合TG酶处理组肉糜的MHC条带略深于其他处理组，其他条带没有明显差异，可能应用欧姆加热这种快速加热的方式可以有效抑制肉品内部内源酶作用，试验结果与苑善振等[18]和Tadpitchayangkoon等[9]研究的肉糜制品结论较为一致。

图1 欧姆加热和水浴加热（添加或不添加TG酶）猪肉糜制品蛋白电泳分析

2.6 扫描电镜分析

图2显示4个处理组猪肉糜样品扫描电镜分析。欧姆加热和水浴加热后的猪肉糜样品（无TG酶）无明显差异，形成的内部结构是多孔松散的。水浴加热猪肉糜样品（含0.5% TG酶）内部结构仍然是多孔松散的，而欧姆加热猪肉糜样品（含0.5% TG酶）的孔隙略较，结构更为紧密。Chin等[16]认为，TG酶与肉中蛋白质交联反应可以降低肌纤维内部之间的孔隙，而不加入TG酶的样品结构更为松散。Ngel-Rendón等[21]研究平底锅、欧姆加热、真空以及慢炖方式加热猪肉到相同终点温度（65～70 ℃），肌纤维结构表明，欧姆加热的肌纤维结构更为紧密、空隙较小。试验结果与Chin等[16]和Ngel-Rendón等[21]研究结论大致一致。

图2 欧姆加热和水浴加热（添加或不添加TG酶）猪肉糜制品扫描电镜分析（×500倍）

3 结论

欧姆加热猪肉糜样品处理组的加热时间为水浴加热处理组时间的1/6～1/2，没有经过TG酶处理时，欧姆加热处理组a*（-0.5）和压榨损失（20.06%）显著低于水浴加热处理组凝胶（p＜0.05），其他指标（质构特性、凝胶结构、电泳分析）2个处理组之间无明显差异。经过0.5% TG酶处理时，欧姆加热处理组样品的破碎力（1 305.34 g）和凝胶强度（1 184.21 g·cm）显著高于水浴加热处理组样品（p＜0.05），其形成的内部结构略为致密。经过0.5% TG酶处理的猪肉糜样品肌纤维蛋白MHC条带略为深于未经过TG酶处理组样品。其他指标无明显差异，因此欧姆加热（经0.5% TG酶）肉糜制品可以形成与传统水浴加热处理组相当的食用品质，后续研究可针对TG酶的酶解条件进行摸索，结合欧姆加热，进一步提升肉品的食用品质。