羊粪有机肥对洛阳植烟土壤微生物群落结构和功能的影响

李正辉，殷全玉，马君红，孟祥瑞，李丽华，周俊学，王玉洁，刘国顺，石秋环

（1．河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2．河南省烟草公司洛阳市公司，河南 洛阳 471000）

化肥是重要的农业生产资料，有利于农作物增产增收，但长期过量施用化肥会导致肥料效应报酬递减，地力下降［1，2］，土壤生物活性降低，从而制约产量品质形成［3，4］。适量施用有机肥能够优化土壤耕层结构，改善植烟土壤理化性状，为微生物生长提供良好生境［5］。但是有机肥养分释放缓慢，作物生长发育对养分需求量大，仅施用有机肥无法满足需要。研究表明，化肥配施有机肥可以改善土壤理化特性，促进土壤团聚体形成，改善土壤微生物群落结构［6］，又可以满足作物对养分的需求［7］，降低病害发生［8］。

微生物是土壤生态系统健康的重要指标［9］，相比土壤理化指标，微生物能够更快速表征土壤质量变化。何冬冬等［10］研究发现，土壤类型为砂壤土时，有机肥改变了真菌群落结构，土壤中腐生营养型真菌的比例显著提升，稻草配施化肥能够有效降低长期轮作的土传病害风险并提高土壤肥力。赵力光等［11］研究认为，降低化肥比例，配施生物有机肥能够改善土壤微生物区系，同时降低病原菌数量。杨宇虹等［12］使用Biolog ECO平板分析法研究表明，农家肥最有利于土壤微生物的生长，有机肥次之，复合肥效果最差。李栋宇等［13］利用砂壤土使用Biolog ECO平板分析法进行研究表明，有机、无机肥配施显著提高土壤微生物多样性、均一性指数，与单施化肥相比提高了85%～310%。马宜林等［14］研究发现，等量施肥条件下羊粪有机肥与无机肥配施比率影响了烟株地上部生长发育和根系构建，在洛阳丘陵褐土区配施40% ～60%羊粪有机肥更有利于满足烤烟的需肥规律，改善烟株生长，维持烟区土壤肥力。

河南省是典型浓香型烟叶产区，洛阳是河南烟叶主产区之一，有机肥对烟草生产起着重要作用，饼肥是传统的烟用有机肥，可以显著改善烟草质量，但价格较贵。羊粪价格低廉，在洛阳烟区有较为稳定和丰富的来源。本试验以饼肥和羊粪作为有机肥原料，均以50%的比例与无机肥氮配施，探究其对洛阳植烟土壤微生物群落结构和功能的影响，以期为烟田土壤改良和科学施肥提供依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料与试验地概况

试验于2019年在河南省洛阳市洛宁县小界乡王村烟草试验站（34°26′N，111°38′E）进行，该地属丘陵地带，年平均气温13．7℃，年降水量600～800mm，土壤质地为褐土，土壤基础肥力：速效磷30．29mg/kg，速效钾129．36 mg/kg，速效氮80．50 mg/kg，全碳0．89%，全氮0．14%，pH 7．51。洛阳主栽品种LY1306作供试烟草。

1．2 试验设计

试验共设4个处理，不施肥（CK）、单施化肥（T1）、50%饼肥氮+50%化肥氮（T2）、50%羊粪有机肥氮+50%化肥氮（T3）。除CK外，其余处理施氮量均为45 kg/hm2，每个处理4次重复，小区面积80 m2，地边设2行保护行。氮磷钾比1∶2∶3，试验用羊粪有机肥、饼肥、烟草专用复混肥、重过磷酸钙和硫酸钾根据当地习惯在4月1日一次性条施，5月4日移栽，5月13日追施硝酸钾肥75 kg/hm2，条施。各处理其他管理方式一致，9月底采收完成。

1．3 土壤微生物取样与分析

土壤样品采集：烤烟移栽70 d后采用五点取样法采集烟草根系周围土壤样品，混合均匀，剔除植物残体等杂质，迅速用干冰冷藏土样，带回实验室后过2 mm筛，-80℃保存。

土壤DNA 提取和PCR 扩增：根据E．Z．N．A．®soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U．S．）说明书进行土壤总DNA提取，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度；采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，使用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对ITS基因ITS1可变区进行PCR扩增。PCR反应体系：5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，dNTPs（2．5 mmol/L）2μL，上游引物（5mol/L）0．8μL，下游引物（5 mol/L）0．8μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0．4μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足至20μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共27个循环；72℃延伸10 min。4℃保存。

Illumina Miseq测序：将同一样本的PCR产物混合，使用2%琼脂糖凝胶进行电泳后利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行产物回收、纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用QuantusTMFluorometer（Promega，USA）对回收产物进行检测。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库：（1）接头链接；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR扩增进行文库模板的富集；（4）磁珠回收PCR产物得到最终文库。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。原始数据上传至NCBI SRA数据库。

数据处理方法：使用fastp［15］软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH［16］软件进行拼接：（1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N 碱基的reads；（2）根据PEreads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成一条序列，最小overlap长度为10 bp；（3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0．2，筛选不符合序列；（4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。

使用UPARSE［17］软件，根据97%［18］的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDPClassifier［19］对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库（version 138）和UNITE 8．0 ITS database数据库，设置比对阈值为70%。

1．4 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2019整理数据，利用DPS软件的LSD法（P＜0．05）做处理间差异性分析，选择97%相似度的OTU进行alpha多样性分析，采用LEfSe软件根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析（LDA），Qiime计算beta多样性距离矩阵，利用R语言工具统计和作图，利用PICRUSt软件对细菌OTU进行功能预测，利用FUNGuild微生态工具按营养方式对真菌进行功能预测。

2 结果与分析

2．1 植烟土壤微生物群落alpha多样性分析

2．1．1 稀释曲线 对16个土壤样本（4个处理×4次重复）测序，每个处理的测序数量均超过40 000条，细菌群落聚类划分后得到6 564个OTU，归类于38个门133个纲312个目505个科975个属1 980个种；真菌群落聚类划分后得到1 954个OTU，归类于16个门43个纲94个目234个科490个属778个种。

图1 土壤细菌（a）和真菌（b）群落多样性稀释曲线

稀释曲线（图1）表明，随着测序数量的增加，稀释曲线趋于平稳，增加测序数量并无新物种出现，说明测序数量达到饱和，当前测序量能够反应样本的真实情况。

2．1．2 alpha多样性指数 对不同处理的土壤微生物群落OTU进行alpha多样性分析，分别用Chao1指数（物种丰富度估量值）、Heip指数（群落均匀度指数）、Shannon指数（多样性指数）、Simpson指数（多样性指数）4个常用度量指标探究各处理内微生物群落结构特征。由表1可知，与饼肥处理（T2）相比，羊粪有机肥处理（T3）降低了烟草土壤细菌群落结构的多样性和丰富度，OTU数量有所减少，但提高了土壤真菌群落结构的多样性和均匀度。

表1 各处理alpha多样性指数

2．2 植烟土壤微生物群落组成

土壤样品在门水平上检测到9种相对丰度大于1%的细菌，其中有4种相对丰度大于10%，相对丰度占总量超过80%。如图2所示，土壤细菌优势门为放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteriota）。与T1处理比较，T2和T3处理放线菌门的相对丰度均有所提升，表现为T2（39．9%）＞T3（38．5%）＞T1（36．4%）；变形菌门相对丰度处理间表现为T3（18．1%）＞T2（16．2%）＞T1（15．7%）；酸杆菌门相对丰度表现为T1（15．3%）＞T3（12．8%）＞T2（12．6%）。与单施化肥相比，有机肥配施化肥增加了放线菌门和变形菌门的相对丰度，降低了酸杆菌门的相对丰度，其中饼肥处理放线菌门丰度增加更为显著，羊粪有机肥处理变形菌门丰度增加幅度较大。

土壤样品中检测到的相对丰度大于1%的真菌有5个门，其中子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）的相对丰度大于10%。与T1处理相比，T2和T3处理土壤中子囊菌门的相对丰度分别提高了12．7%和10．0%；被孢霉门的相对丰度表现为T1（16．8%）＞T3（12．5%）＞T2（9．2%）。与单施化肥相比，有机肥配施化肥增加了子囊菌门的相对丰度，降低了被孢霉门的相对丰度（图3）。

图2 细菌在门水平上的相对丰度

图3 真菌在门水平上的相对丰度

在科水平上，相对丰度大于1%的细菌共有26个，其中微球菌科（Micrococcaceae）、JG30-KF-CM45、地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）相对丰度大于5%。饼肥处理和羊粪有机肥处理土壤中的微球菌科、地嗜皮菌科和鞘脂单胞菌科相对丰度高于不施肥和仅施化肥处理（图4）。

在科水平上，相对丰度大于1%的真菌共有19个，其中绿藻科（Piskurozymaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、木兰科（Mrakiaceae）、发菌科（Trichocomaceae）、从赤壳科（Nectriaceae）和毛壳菌科（Chaetomiaceae）的相对丰度大于5%。T2和

T3处理土壤中绿藻科和被孢霉科相对丰度低于CK和T1，其中T2和T3处理的被孢霉科相比CK分别降低了7．9%和4．3%；T2处理木兰科的相对丰度显著高于CK和T1；T2处理中发菌科显著富集，相对丰度达30%以上，明显高于其余处理；T3处理的从赤壳科相对丰度明显高于其他处理（图5）。

2．3 LEfSe多级物种差异判别分析

2．3．1 细菌LEfSe多级物种层级树和LDA判别结果 LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件。LEfSe采用线性判别分析（LDA）估算每个组分（物种）丰度对差异效果影响的大小。从门水平到属水平各个分类单位设定LDA阈值为3。由图6可知，CK处理拟杆菌门（Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）等显著富集；T1处理红色杆菌纲（Rubrobacteria）、红色杆菌目（Rubrobacterales）等显著富集；T2处理样本中放线菌门（Actinobacteriota）、放线菌纲（Actinobacteria）、Frankiales目等显著富集；T3处理样本中鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、丙酸杆菌目（Propionibacteriales）等显著富集。

2．3．2 真菌LEfSe多级物种层级树和LDA判别结果 从门水平到属水平各个分类单位设定LDA阈值为3。由图7可以看出，CK主要优势菌群为被孢菌门（Mortierellomycota）、被孢菌目（Mortierellales）、被孢菌纲（Mortierellomycetes）等；T1的优势种群为新赤壳属（Neocosmospora）、Paramyrothecium属等；T2的优势菌群为发菌科（Trichocomaceae）、黄色篮状菌属（Talaromyces）、散子囊菌目（Eurotiales）等；T3的优势菌群为粪壳菌纲（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、葡萄座腔菌目（Pleosporales）等。

图4 细菌在科水平上的相对丰度

图5 真菌在科水平上的相对丰度

图6 细菌LEfSe多级物种层级树图（a）和LDA判别结果（b）

图7 真菌LEfSe多级物种层级树图（a）和LDA判别结果（b）

2．4 植烟土壤微生物群落beta多样性分析

基于Bray-Curtis距离对4个处理的土壤微生物群落组成进行NMDS分析。由图8a（细菌NMDS分析图）可以看出，T3和T2处理细菌群落组成均与CK和T1存在明显差异，说明羊粪有机肥和饼肥处理改变了土壤细菌群落组成，但二者间有相似之处也有差异；由图8b（真菌NMDS分析图）可知，CK和T1的组成较为相似，T2和T3处理与其有较大差异。说明有机肥配施化肥可以改变真菌的菌群结构，但羊粪有机肥和饼肥的效果又有所不同。

2．5 功能预测

通过PICRUSt软件对细菌OTU信息进行功能预测，得到COG功能分析图（图9），不同施肥处理土壤相对丰度大于5%的功能基因包括能量生产与转化（energy production and conversion）、氨基酸转运与代谢（amino acid transport and metabolism）、碳水化合物的运输与代谢（carbohydrate transport and metabolism）、翻译核糖体结构和生物发生（translation，ribosomal structure and biogenesis）、转录（transcription）、细胞壁/膜/包膜生物发生（cell wall/membrane/envelope biogenesis）、无机物运输和代谢（inorganic ion transport and metabolism）。各个处理之间关于细菌功能的差别不明显。

图8 土壤细菌（a）和真菌（b）NMDS分析图

图9 细菌COG功能丰度统计function柱形图

图10 真菌FUNGuild功能分类统计结果

利用FUNGuild微生态工具，对真菌群落进行功能预测，如图10所示，各处理按照环境资源的利用途径分成病理营养型（pathotroph）、腐生营养型（saprotroph）两个功能分类，对营养类型进一步分类得到多种功能。与T1处理相比，T2处理未定义腐生菌（undefined saprotroph）的相对丰度增加；T3处理明显增加了土壤动植物病原菌（animal pathogen-endophyte-lichen parasite-plant pathogensoil saprotroph-wood saprotroph，animal pathogenplant pathogen-undefined saprotroph）相对丰度，降低了腐生营养型真菌（undefined saprotroph，endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph），但其中粪腐生菌（dung saprotroph）相对丰度显著高于其他处理。

3 讨论与结论

土壤微生物是土壤微生态的重要组成成分，影响土壤理化特性，参与土壤养分循环，改善土壤肥力［20-23］，对维持土壤质量及促进植物生长等有重要作用。丰富的微生物群落多样性可以缓解烟田连作障碍，提高土壤有机质含量，释放促进农作物生长的有益元素，从而影响农作物的生长发育［24，25］。

3．1 羊粪有机肥配施化肥对根际土壤细菌群落结构和功能的影响

相比饼肥，羊粪有机肥处理改变了细菌群落的alpha多样性，土壤OTU数量减少，细菌多样性和丰富度有所降低。对细菌群落柱形图和LEfSe层级图进行分析可知，相比单施化肥，羊粪有机肥处理使土壤放线菌门的相对丰度有所提升，放线菌能够有效分解动植物残体，供给土壤养分［26］；变形菌门的相对丰度显著高于其他处理，变形菌门是细菌中的重要成员，有固氮作用，同时和土壤速效养分密切相关［27］。羊粪有机肥土壤酸杆菌门的相对丰度和饼肥处理接近；饼肥和羊粪有机肥处理土壤中微球菌科、地嗜皮菌科和鞘脂单胞菌科相对丰度有所提高，这说明有机肥可以改变优势细菌种类，这与Ren［28］、蒋雨洲［29］等的研究结果一致。从土壤细菌NMDS分析图可以看出，T2和T3处理细菌群落结构相对于CK和T1处理有明显差别，说明有机肥配施化肥可以改变细菌群落结构，但饼肥和羊粪有机肥对群落结构的影响有相同之处也有不同之处。施肥对烟草根际土壤细菌的功能类群改变不明显。

3．2 羊粪有机肥配施化肥对根际土壤真菌群落结构和功能的影响

相比不施肥处理，施肥增加了土壤真菌群落的OTU数量；相比饼肥处理，羊粪有机肥处理的多样性和均匀度有所提高。由真菌群落柱形图和LEfSe层级图可以看出，与T1处理相比，T2和T3处理土壤子囊菌门的相对丰度分别提高了12．7%和10．0%，子囊菌门可以促进动植物残体的分解［30］；被孢霉门的相对丰度均有所降低。羊粪有机肥处理土壤样品的从赤壳科和粪壳菌纲显著富集，而绿藻科和被孢霉科有所降低。从真菌NMDS图可以看出，羊粪有机肥处理和饼肥配施化肥处理都对真菌微生物群落结构影响明显，但饼肥和羊粪有机肥的影响并不相同。羊粪中含有大量的有机质，利于真菌的生长，真菌能够分解动植物残体、动物粪便等有机质使其能被植物吸收利用［31］。真菌的富集说明羊粪有机肥增强了土壤的分解能力，更利于植物自身吸收营养物质，推动了腐殖化进程。从真菌功能类群上看，羊粪有机肥处理腐生营养型真菌的相对丰度有所降低，增加了动植物病原菌的相对丰度，在利用羊粪进行土壤改良时，应尤其注意进行充分腐熟或者与功能菌共发酵，形成生物羊粪有机肥加以利用。

有机肥可以通过对微生物群落的影响进而影响土壤健康。本研究发现，羊粪有机肥配施化肥和饼肥配施化肥都可以改变土壤微生物群落结构多样性和功能类群，但饼肥成本较高，羊粪有机肥价格低廉，更具有推广优势，但在应用中应加强对病原菌的防控。