超声辅助柠檬酸法优化草鱼鱼鳞脱钙工艺

郝星海，张峥，夏牧秋，石梦瑶，秦纪宁，丁云桥*

齐鲁工业大学（山东省科学院）化学与化工学院（济南 250353）

渔业生产的水产品加工过程中会产生大量下角料，若不进行妥善处理，会对环境造成不良影响[1]。鱼鳞是水产品加工过程中主要废料之一，研究分析表明其内含有丰富的矿物质和蛋白质，蛋白质含量占鱼鳞总质量的一半以上，其中以胶原蛋白含量最为丰富[2]。鱼鳞胶原来源广泛，鱼鳞中提取胶原不仅能减少环境污染，还能解决口蹄疫、疯牛病等带来的胶原蛋白安全性问题。将鱼鳞“变废为宝、重新利用”不仅可以避免发生安全性问题，还可以提升鱼产品的附加值[3-5]。

近年来，国内学者对鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等进行胶原提取脱钙工艺的优化[6-8]，对草鱼鱼鳞脱钙工艺的研究相对较少。草鱼作为淡水鱼中的“四大家鱼”之一，人工养殖多，繁殖快[9]，鱼鳞约占鱼体比重2.5%，其中含有丰富的胶原蛋白，可作为胶原提取的重要原料，且易获价廉[10-12]。

鱼鳞中含有大量矿物质，如磷酸盐、碳酸盐、羟基磷灰石等，以羟基磷灰石占比最高，且与胶原蛋白粘附紧密，难以分离，这极大影响了胶原蛋白提取率[10]。所以，脱钙工艺的优化成为鱼鳞胶原提取的关键。常见鱼鳞脱钙方法有酸法和螯合法[13-14]。螯合剂EDTA价格昂贵，不适用于大规模的工业生产，而盐酸作为一种强酸，会使一部分胶原蛋白流出，造成损失，导致其经济效益的降低[15]。

采用弱酸柠檬酸为脱钙剂，结合超声波的空化作用，在液体中产生巨大的压力迫使钙离子溶出，缩短脱钙时间，提高脱钙效率。在单因素试验的基础上进行L9(34)正交试验，在确保胶原蛋白低损耗的情况下，确定最佳脱钙工艺。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

草鱼鱼鳞（收集于济南市市中区海鲜大市场，清洗干净，晾干备用）。

氯化钙（天津市登科化学试剂有限公司）；对二甲氨基苯甲醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氨水、氯化铵、盐酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、柠檬酸、氢氧化钠、无水乙酸钠、硫酸、异丙醇（国药集团化学试剂有限公司）；L-羟基脯氨酸（纯度99%）、铬黑T、氯胺T（上海麦克林生化科技有限公司）；所用试剂均为分析纯。

BSA124S赛多利斯高精度分析天平（上海锡为科学仪器有限公司）；雷磁PHSJ-4A实验室pH计（上海仪电科学股份有限公司）；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UV-2600紫外-可见近红外分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验设计

1.2.1.1 超声时间对脱钙率的影响

准确称取1.00 g鱼鳞，置于50 mL烧杯中，控制柠檬酸质量分数3%、料液比1∶20 g/mL、超声功率为200 W。在上述条件下，探究超声时间（30，40，50，60，70，80和90 min）对脱钙率的影响，以羟脯氨酸溶出率做评价指标。

1.2.1.2 柠檬酸质量分数对脱钙率的影响

准确称取1.00 g鱼鳞，置于50 mL烧杯中，控制超声时间1 h、料液比1∶20 g/mL、超声功率为200 W。在上述条件下，探究柠檬酸质量分数（3%，4%，5%，6%，7%，8%和9%）对脱钙率的影响，以羟脯氨酸溶出率做评价指标。

1.2.1.3 料液比对脱钙率的影响

准确称取1.00 g鱼鳞，置于50 mL烧杯中，控制超声时间1 h、柠檬酸质量分数3%、超声功率为200 W。在上述条件下，探究料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）对脱钙率的影响，以羟脯氨酸溶出率做评价指标。

1.2.1.4 超声功率对脱钙率的影响

准确称取1.00 g鱼鳞，置于50 mL烧杯中，控制超声时间1 h、柠檬酸质量分数3%、料液比1∶20 g/mL。在上述条件下，探究超声功率（100，125，150，175，200，225和250 W）对脱钙率的影响，以羟脯氨酸溶出率做评价指标。

1.2.2 正交试验设计

在单因素试验基础上，选取最优值及最优值两侧数值作为3个水平，选择超声时间（A）、柠檬酸质量分数（B）、料液比（C）、超声功率（D）为4个影响因素进行L9(34)进行正交试验。试验因素与水平如表1所示。

1.2.3 脱钙率的测定

1.2.3.1 钙离子标准曲线的绘制

根据蒋柏泉等[16]的方法略做修改，将滴定时补充蒸馏水总体积改为50.0 mL。称取一定量烘干至恒重的无水氯化钙，配制成2 mg/mL的氯化钙标准溶液，分别取0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0 mL钙离子标准液于150.0 mL锥形瓶中，每瓶内准确补充蒸馏水至总体积50.0 mL，随后加入5.00 mL氨水-氯化铵缓冲液（pH 10）和3滴铬黑T指示剂，摇匀后用0.01 mol/L的EDTA标准溶液滴定。溶液由酒红色变为蓝色时为滴定终点，记录EDTA消耗体积，平行滴定3次，取平均值。分别以EDTA滴定消耗体积为横坐标，钙离子质量浓度为纵坐标绘制钙离子的标准曲线，得到该曲线的线性回归方程。

1.2.3.2 鱼鳞中总钙含量的测定

将鱼鳞先后放入5% NaCl溶液、0.5 mol/L的Na2CO3溶液中，在一定磁力转速下搅拌12 h，除去鱼鳞表面的脂质，晾干后备用。将预处理好的鱼鳞准确称取3.00 g，按料液比1∶20加入1 mol/L盐酸溶液中，并在室温下磁力搅拌24 h。处理完成后将液体转移至100 mL容量瓶定容，用0.01 mol/L EDTA溶液进行滴定并计算出钙离子含量，按式（1）计算。

式中：T为由标准曲线所得钙离子质量浓度，mg/mL；V1为加入盐酸的体积，mL；D为稀释倍数；M为鱼鳞总质量，g。

1.2.3.3 脱钙液中钙含量的测定

取1.00 mL脱钙液，准确补充蒸馏水至总体积50 mL，加入5.00 mL氨水-氯化铵缓冲溶液（pH 10）和3滴铬黑T指示剂。摇晃均匀后用0.01 mol/L的EDTA标准溶液滴定，当溶液由酒红色变为蓝色时达滴定终点。通过钙离子标准曲线得出脱钙液中钙离子的含量，按式（2）计算。

式中：T为由标准曲线所得钙离子质量浓度，mg/mL；V2为加入柠檬酸的体积，mL；D为稀释倍数；M为鱼鳞总质量，g。

1.2.3.4 脱钙率的计算

依据脱钙液中总的钙离子含量比上鱼鳞中总的钙离子含量，所得数值即为脱钙率C，按式（3）计算。

式中：A为脱钙液中钙离子含量，%；B为鱼鳞中总钙离子含量，%。

1.2.4 羟脯氨酸溶出率的测定[17]

1.2.4.1 氯胺T溶液及显色剂的配制

称取2.6 g一水柠檬酸、1.4 g氢氧化钠、7.8 g无水乙酸钠配制成pH=6.8的缓冲溶液，加入25 mL的异丙醇，用水定容至100 mL。用上述缓冲溶液溶解1.41 g的氯胺T，配制成氯胺T溶液，此溶液临用前现配。

称取5.0 g对二甲氨基苯甲醛，用17.5 mL质量分数60%的高氯酸溶解，缓慢加入32.5 mL异丙醇，冷却至室温备用。溶液临用前现配。

1.2.4.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

准确称取50 mg羟脯氨酸，用水溶解并加入1滴硫酸溶液（3 mol/L）定容至100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的羟脯氨酸标准储备液。

移取5 mL上述标准储备液至500 mL容量瓶中，用水定容。分别移取上述溶液5，10，15，20和25 mL于50 mL容量瓶中，用水定容，得到不同浓度的羟脯氨酸标准溶液。

移取4 mL上述溶液于试管中，加入2 mL氯胺T试剂，混合后在室温下放置20 min。加入2 mL显色剂，充分混合后用不透明的塑料薄膜封口，迅速放入60 ℃水浴锅中加热20 min，取出后用流动水冲洗3 min，在室温下放置30 min，于558 nm处进行吸光度测定。每组试样重复测定3次，取平均值后，以羟脯氨酸的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用Excel绘制羟脯氨酸标准曲线。

1.2.4.3 鱼鳞中羟脯氨酸含量的测定

称取1.00 g鱼鳞，取30 mL 3 mol/L的硫酸于50 mL烧杯中，在105 ℃干燥箱内水解16 h，取出稀释一定倍数后，进行显色反应和吸光度测定，方法同1.2.4.2。根据式（4）计算出脱钙液中羟脯氨酸含量。

式中：T’为由标准曲线所得羟脯氨酸质量浓度，μg/mL；V3为加入硫酸体积，mL；D为稀释倍数；M为鱼鳞总质量，g。

1.2.4.4 脱钙液中羟脯氨酸含量的测定

取一定量脱钙液稀释一定倍数后，进行显色反应和吸光度测定，方法同1.2.4.2小节。根据式（5）计算出脱钙液中羟脯氨酸含量。

式中：T’为滴定后由标准曲线所得羟脯氨酸质量浓度，μg/mL；V4为脱钙液体积，mL；D为稀释倍数；M为鱼鳞总质量，g。

1.2.4.5 羟脯氨酸溶出率的计算

依据脱钙液中总的羟脯氨酸含量比鱼鳞中总的羟脯氨酸含量，所得数值即为羟脯氨酸溶出率，按式（6）计算。

式中：Y为脱钙液中羟脯氨酸含量，%；X为鱼鳞中总羟脯氨酸含量，%。

2 结果与分析

2.1 钙离子标准曲线的绘制

钙离子浓度和EDTA的体积关系如图1所示。钙离子的标准曲线为y=0.009 6x+0.000 7，R2=0.999 8，表明钙离子浓度与滴定所用的EDTA体积间具有良好线性关系。

图1 钙离子标准曲线

2.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

羟脯氨酸浓度和吸光度关系如图2所示。羟脯氨酸的标准曲线为y=0.175 2x+0.007 7，R2=0.997 5，表明吸光度与羟脯氨酸浓度间有较好线性关系。

图2 羟脯氨酸标准曲线

2.3 单因素试验结果

2.3.1 超声时间对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

超声时间对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响见图3。随着超声时间增加，钙离子与柠檬酸分子接触时间增加，脱钙率缓慢增长，在70 min时达到最大值90.4%，随后缓慢下降。随着超声时间的增加，羟脯氨酸的溶出率始终低于1.68%。说明在70 min条件下，鱼鳞的脱钙效果好，且胶原蛋白损失量少。

图3 超声时间对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

2.3.2 柠檬酸质量分数对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

柠檬酸质量分数对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响见图4。随着柠檬酸质量分数增加，脱钙率缓慢增长，在6%时达到最大值，之后随浓度增大而缓慢下降。提升反应浓度有利于钙离子与柠檬酸分子反应促进脱钙。随着柠檬酸浓度增加，羟脯氨酸的溶出率一直低于1.29%，胶原蛋白的损失量少。说明在柠檬酸质量分数6%的条件下，鱼鳞的脱钙效果较好。

图4 柠檬酸质量分数对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

2.3.3 料液比对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

料液比对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响见图5。提取液体积对脱钙率的影响较大，料液比1∶10和1∶15 g/mL时，脱钙效果非常不理想。随着料液比增加，脱钙率逐渐增长，在1∶25 g/mL时出现最大值，继续增大料液比后缓慢下降。原因可能是在脱钙液浓度不变的情况下，随着体积增加，鱼鳞与脱钙液接触面积增大，料液比增加至1∶25 g/mL时，鱼鳞中的钙离子已与柠檬酸分子充分结合，脱钙率不再随脱钙液体积的增加而上升。随着料液比增加，羟脯氨酸溶出率一直低于4.11%。说明在料液比1∶25 g/mL条件下，鱼鳞的脱钙效果较好，且胶原蛋白的损失量较少。

图5 料液比对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

2.3.4 超声功率对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

超声功率对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响见图6。随着超声功率增加，脱钙率缓慢增长，而在175～200 W间出现较大涨幅，猜想可能是超声能转化为热能促进脱钙，还可能是由于超声波的空化作用，加速了鱼鳞中的钙离子进入到脱钙液中，提升了脱钙率，在达到200 W最大值后缓慢下降。随着超声功率的增加，羟脯氨酸的溶出率一直低于1.75%，说明在超声功率200 W条件下，鱼鳞的脱钙效果较好，且胶原蛋白的损失量较少。

图6 超声功率对脱钙率和羟脯氨酸溶出率的影响

2.4 正交试验设计分析

根据单因素试验结果，选取超声时间60，70和80 min，柠檬酸质量分数5%，6%和7%，料液比1∶25，1∶30和1∶35 g/mL，超声功率175，200和225 W进行正交试验，设计L9(34)正交试验表（见表2）进行试验。由正交试验表中极差R可知，影响鱼鳞脱钙率的因素主次顺序为A＞C＞D＞B，即超声时间＞料液比＞超声功率＞柠檬酸质量分数。

利用IBM SPSS 26.0进行方差分析，结果见表3。试验中各因素对草鱼鱼鳞脱钙率均有影响，其中时间因素影响显著（p＜0.05），即超声时间是决定脱钙率的关键性因素。p值越小显著性越强，影响越显著。由正交试验方差分析可知，pA＜pC＜pD＜pB，影响鱼鳞脱钙率的因素主次顺序为A＞C＞D＞B，即超声时间＞料液比＞超声功率＞柠檬酸质量分数，与极差的分析结果一致。

表3 正交试验方差分析表

由表2可知，理论最优为A3B1C3D3，在此条件下试验得脱钙率为92.7%，低于正交表中第7组数值93.8%。综合考虑影响鱼鳞脱钙的因素水平，选取最优参数组合A3B1C2D2，即超声时间80 min、柠檬酸质量分数5%、料液比1∶25 g/mL、超声功率200 W。此条件在正交试验表的第7组出现，测定脱钙率为93.8%。

表2 L9(34)正交试验结果

3 结论

试验采用超声波辅助柠檬酸的方法对草鱼鱼鳞脱钙工艺进行优化。用单因素试验探究超声时间、柠檬酸质量分数、料液比、超声功率对鱼鳞脱钙的影响，经正交试验选取最佳脱钙工艺。经正交试验极差及方差分析可知，决定脱钙率的4个因素的影响顺序为超声时间＞料液比＞超声功率＞柠檬酸质量分数。最佳脱钙工艺条件为超声时间80 min、柠檬酸质量分数5%、料液比1∶25 g/mL、超声功率200 W时，脱钙率可达93.8%，而羟脯氨酸的溶出率仅1.38%，证明超声辅助柠檬酸脱钙效果影响显著。优化后的工艺脱钙用时较短，胶原蛋白损耗量少，可应用于实际生产。试验结果为草鱼鱼鳞脱钙工艺提供明确的试验参数，也为鱼鳞胶原蛋白的提取规模化生产提供良好技术参考。