沉默信息调节因子2同系物1在人瘢痕疙瘩组织中的表达及其与氧化应激指标相关性研究

霍君艺，赵卓伟，段策中，华 振，荆银磊，孟祥海

(空军军医大学唐都医院烧伤整形科，陕西 西安 710038)

瘢痕疙瘩是皮肤伤口愈合或不明原因所致皮肤损伤愈合后所形成的过度生长的异常瘢痕组织，其通常表现为病变部位超出原始皮肤损伤范围，并呈现可持续性生长特征，主要形状为结节状、条索状或片状[1-2]。目前，根据大小可将其分为小型瘢痕疙瘩(直径<2.0 cm)、中大型瘢痕疙瘩(长度2.0～10.0 cm，宽度<5.0 cm)和超大型瘢痕疙瘩(长度>10.0 cm，宽度≥5.0 cm)。对于不同类型的瘢痕疙瘩，采取不同的治疗手段，主要包括药物治疗、手术治疗和放射治疗[3-4]。然而，由于瘢痕疙瘩发病机制目前尚未明确，难以被治愈，因此研究瘢痕疙瘩的发病机制对开发瘢痕疙瘩的新疗法意义重大。沉默信息调节因子2同系物1(Silent information regulator 2 homologue 1，SIRT1)是一种在人体各种组织广泛表达的蛋白质。同时，SIRT1作为Sirtuin家族的重要成员，也是一种组蛋白去乙酰化酶，可以通过对多种组蛋白的调控而参与细胞增殖、分化、凋亡和死亡的调控[5-6]。研究[7]发现，SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS依赖性自噬通路与基于5-氨基乙酰丙酸的光动力疗法治疗瘢痕疙瘩的临床疗效有关。此外，SIRT1有希望成为肥厚性瘢痕的治疗靶点[8]。然而，目前关于SIRT1在瘢痕疙瘩组织中的表达报道较少。鉴于此，本研究通过实时荧光定量PCR(qPCR)法和免疫印迹法检测人瘢痕疙瘩组织中SIRT1基因表达，并探讨SIRT1表达与氧化应激指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2021年12月在我院接受治疗的瘢痕疙瘩患者82例，其中男性49例，女性33例；年龄22～63岁，平均(45.36±9.82)岁；胸部39例，腹部25例，肩部10例，耳后8例；病程3～16个月，平均(8.91±1.02)个月。病例纳入标准：①所有患者均未服用瘢痕抑制类药物治疗；②临床病理诊断无恶变；③瘢痕组织未行物理治疗；④患者均知情同意。排除标准：①合并皮肤疾病；②合并恶性肿瘤或传染性疾病；③瘢痕组织局部出现感染。本研究已通过医院伦理委员会审批。

1.2 研究方法 根据病程不同将82例瘢痕疙瘩患者分为A组(0～6个月，30例)、B组(6～12个月，27例)和C组(>12个月，25例)。每份瘢痕疙瘩组织标本根据生长期分为浸润部、增生部和老化部，并且每份瘢痕疙瘩组织取正常皮肤组织1份作为对照。检测每位患者正常组织和瘢痕疙瘩组织(浸润部、增生部和老化部)中SIRT1基因表达情况，取多次检测的平均值。此外，检测正常组织和瘢痕疙瘩组织p65蛋白和p-p65蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及晚期氧化蛋白产物(AOPP)水平。

1.2.1 SIRT1 mRNA表达检测：通过组织RNA提取试剂盒(批号：R218，北京金百特生物科技有限公司)提取正常组织和瘢痕疙瘩组织总RNA，然后使用反转录试剂盒(批号：205111，北京凯幕生物科技有限公司)将提取的RNA反转录为cDNA，最后按照qPCR试剂盒(批号：LS-0064，重庆唯尚立德生物科技有限公司)说明书配置反应体系以检测SIRT1 mRNA表达。SIRT1正向引物序列为5’-GGCTCTATACACAGAACATCGAC-3’，反向引物序列为5’-ATCATCGGCATTTTGAACGAGG-3’。内参β-actin正向引物序列为5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’， 反向引物序列为5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’。

1.2.2 SIRT1、p65和p-p65蛋白表达检测：通过组织蛋白提取试剂盒(批号：BB-3122-2，北京安鑫康科技有限公司)提取正常组织和瘢痕疙瘩组织总蛋白，然后采用BCA试剂盒(批号：23227，北京科创欣达科技有限公司)检测总蛋白浓度。将50 μg总蛋白使用10% SDS-PAGE胶进行分离后转移至PVDF膜上，利用5% BSA溶液封闭后进行一抗孵育过夜，次日进行二抗孵育，经过压片显影后利用Image J软件对图片进行灰度分析。

2.4 正常组织与瘢痕疙瘩组织SOD、MDA和AOPP水平比较 见表4。瘢痕疙瘩组织中SOD、MDA和AOPP含量显著高于正常组织(均P<0.05)。

2.2 三组患者瘢痕疙瘩组织不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表达水平比较 见表2。在各组内，瘢痕疙瘩组织老化部、增生部SIRT1 mRNA和蛋白表达水平显著高于浸润部，且老化部高于增生部(均P<0.05)。三组间瘢痕疙瘩组织不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

第五，充分发挥各级矿业协会的协调、支撑作用。矿业协会应提供理论指导、技术咨询和第三方评估，加强对典型矿山的宣传和先进企业的经验推介，扩大在全社会范围内的影响。依托绿色矿业发展指导中心、绿色矿业发展战略联盟等机构，适时召开现场交流培训，整体提升矿业领域绿色治理能力。

2 结 果

面对这份要求和重担，研究院党委结合所面临的工作环境，由班子成员带队深入各研究所与机关科室，开展了“访基层、讲形势、聚人心、促工作”集中宣讲，宣讲形势任务和上级政策要求，了解职工思想动态；编发了形势任务教育宣传材料，开展“跨越重大关口，决胜扭亏为盈”形势任务教育；使大家充分认清形势，明确研究院在分公司的定位，增强荣誉感，强化担当意识，在全院干部员工心目中树立和固化“公司增效责任在我，公司发展我来担责”的责任心，鼓励员工以不服输、争口气的劲头，把基础研究工作做得更扎实、更细致、更务实，努力打好翻身仗。

2.3 正常组织与瘢痕疙瘩组织p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比较 见表3。正常组织和瘢痕疙瘩组织p65蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。瘢痕疙瘩组织p-p65蛋白表达水平和p-p65/p65显著高于正常组织(均P<0.05)。

表1 三组患者正常组织和瘢痕疙瘩组织SIRT1 mRNA和蛋白表达水平比较

表2 三组患者瘢痕疙瘩组织不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表达水平比较

床边教学是一种重要的医学教学方式，是以临床带教教师为主导、学生为主体、病人为中心的临床教学模式，一直以来都为世界各国医学院所推崇，在二十世纪前半叶被广泛应用于各医学院校，到60年代约占75%的临床培训时间[2]。床边教学已被描述成为一种理想的临床教学模式，通过专业的病史询问和体格检查，在病人诊治过程中提供一个全面的方法。但近年来，影像医学和实验室检测技术的突飞猛进，使床边教学时间明显减少了，床边教学目前约占医学培训的8%～19%[3]。在本科学习期间，若床边教学这一重要内容减少，可能会导致部分年轻医学生临床技能下降。

表3 正常组织与瘢痕疙瘩组织p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比较

1.2.3 SOD、MDA和AOPP含量检测：将正常组织和瘢痕疙瘩组织经组织匀浆器匀浆后，离心以收集上清，分别采用SOD活性检测试剂盒(批号：BC0170，上海吉至生化科技有限公司)、MDA含量检测试剂盒(批号：BC0020，上海吉至生化科技有限公司)和AOPP ELISA试剂盒(批号：JM-04217H1，深圳市益百顺科技有限公司)进行含量检测。

瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕，以成纤维细胞过度增殖、胶原纤维异常沉积和炎症为特征，表现出类似癌症的特性，不会自发消退，切除后通常会复发。目前，临床上对于瘢痕疙瘩有多种治疗方法，但均被发现有疗效低、不良反应大和复发风险高等特点，而造成瘢痕疙瘩无法被治愈的主要原因是其发病机制依然未被完全揭示[9]。Sirtuins是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，通过对组蛋白和非组蛋白底物的去乙酰化发挥作用而参与衰老、表观遗传学、炎症、癌症和各种其他细胞过程[10]。Sirtuins蛋白家族共有7个蛋白，其中SIRT1是Sirtuins蛋白家族特征最明显的蛋白，参与调节各类细胞活动，包括代谢、增殖、分化、坏死和凋亡，在糖尿病、慢性炎症性肺部、神经退行性疾病、慢性肾病以及多种纤维化疾病的发生与发展中发挥重要作用[11-12]。而瘢痕疙瘩的特征是细胞外基质蛋白的过度产生和沉积，与伤口处成纤维细胞的持续存在有关，所以SIRT1被认为是治疗瘢痕疙瘩的潜在靶点[8]。

表4 正常组织与瘢痕疙瘩组织SOD、MDA和AOPP水平比较

表5 瘢痕疙瘩组织SIRT1 mRNA和蛋白表达与SOD、MDA和AOPP的相关性

3 讨 论

2.5 瘢痕疙瘩组织SIRT1 mRNA和蛋白表达与SOD、MDA和AOPP的相关性 见表5。在82例瘢痕疙瘩组织中，SIRT1 mRNA和蛋白表达水平与SOD、MDA和AOPP呈负相关(均P<0.05)。

2.1 三组患者正常组织和瘢痕疙瘩组织SIRT1 mRNA和蛋白表达水平比较 见表1。各组内，SIRT1 mRNA和蛋白在瘢痕疙瘩组织中的表达水平显著低于正常组织(均P<0.05)。三组间SIRT1 mRNA和蛋白在正常组织和瘢痕疙瘩组织中的表达水平比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

本研究通过qPCR和免疫印迹法分别检测SIRT1 mRNA和蛋白在人瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织中的表达，结果发现SIRT1基因在人瘢痕疙瘩组织中的表达水平显著高于正常皮肤组织，并且与瘢痕疙瘩病程无关，而与其在瘢痕疙瘩组织的表达部位有关。Bai等[8]研究发现，SIRT1在肥厚性瘢痕组织中的表达受到抑制，但与本研究不同，他们进一步探讨了调节SIRT1对治疗肥厚性瘢痕的可能性，而本研究则侧重于研究SIRT1在人瘢痕疙瘩组织表达下调的临床意义。进一步分析可知：第一，在皮肤的各种细胞类型中，成纤维细胞负责合成胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白，并在伤口愈合和瘢痕形成中发挥关键作用[13-14]；第二，皮肤损伤后，成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其特点是表达α-平滑肌肌动蛋白，合成和分泌胶原蛋白的倾向增加，从而促进伤口愈合。然而，伤口愈合后成纤维细胞/肌成纤维细胞的持续存在可能导致瘢痕疙瘩的形成[13-14]；第三，研究表明上调SIRT1的表达可以抑制肾纤维化、肝纤维化和肺纤维化[15-17]，而SIRT1抑制剂则可以通过抑制5-氨基乙酰丙酸诱导的成纤维细胞的凋亡[7]。因此，在人瘢痕疙瘩组织表达降低的SIRT1可能与瘢痕疙瘩的形成有关。

工程量清单计价模式主要起始于21世纪初期，其主要是在我国以往定额计价模式的基础上，通过量、价分离的方式，以市场价格、工程承包方内部定额确定招投标价格。工程量清单计价模式将工程量核算、项目划分及计量单位设置进行了统一管理，而统一工程量计量、项目名称编码及计算规则的设置，也对承包方工程造价控制提出了更高的要求。

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氧化应激指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。近年来，多种氧化应激指标或氧化应激相关通路被发现在瘢痕疙瘩组织中表达异常，表明氧化应激参与了瘢痕疙瘩的形成[18]。基于此，本研究首先检测氧化应激相关通路(核因子-κB信号通路)和氧化应激指标(SOD、MDA和AOPP)在人瘢痕疙瘩组织中的表达，结果发现人瘢痕疙瘩组织p-p65蛋白表达水平和p-p65/p65，以及SOD、MDA和AOPP含量均高于正常组织，这与之前的研究结果一致。重要的是，本研究还发现在82例瘢痕疙瘩组织中SIRT1 mRNA和蛋白表达与氧化应激指标(SOD、MDA和AOPP)均呈负相关。进一步分析可知：瘢痕疙瘩是发病率极高的纤维化疾病，瘢痕疙瘩组织中存在高水平的活性氧(氧化应激程度较高的标志)不仅可以促进一些重要的纤维化细胞因子的表达和分泌，而且参与调控成纤维细胞的增殖和凋亡[19]；而近年来研究[20]表明，SIRT1可以通过其去乙酰化作用在氧化应激状态下调控多种靶蛋白的表达和修饰，包括p53、p65以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)等，以抵抗氧化应激，对细胞的增殖、分化、代谢和凋亡发挥调控作用。

综上所述，SIRT1在人瘢痕疙瘩组织中表达降低，其表达水平与人瘢痕疙瘩病程无关，而与其在瘢痕疙瘩组织中的表达部位有关，并且可能通过抵抗氧化应激而参与瘢痕疙瘩的形成与发展。