阿托伐他汀对小鼠川崎病的治疗作用及机制研究

严晓华，王 娜，马 娟，闫鲜鹏，郑千千

(1.陕西省人民医院，陕西 西安 710068；2.西安市第九医院儿科，陕西 西安 710054)

川崎病1967年首次由Tomisaku Kawasaki描述，是一种以全身中、小动脉炎性病变为主要病理变化的急性热性、全身性血管炎，好发于5周岁以下儿童[1-3]。近年来，其发病率逐年升高。合并冠脉病变的发生率高达20%～25%，严重者可出现冠状动脉瘤，远期可出现瘤体破裂或者栓塞导致缺血性心脏病，已经取代风湿热成为儿科最常见的后天性心脏病，对儿童的身心成长危害很大[4-5]。本病的预后取决于冠状动脉损害的程度。经标准治疗(免疫球蛋白冲击联合阿司匹林)，大部分患儿可取得良好的治疗效果，但仍有部分患儿表现为对静脉注射免疫球蛋白(IVIG)不敏感。随着对川崎病发病机制及病因的研究，一些新的治疗方法不断出现，包括英夫利昔单抗、甲氨蝶呤、环磷酰胺、阿那白滞素、血浆置换、他汀类药物等[6]，但临床治疗的作用机制还处于探索之中。本研究观察阿托伐他汀对小鼠川崎病的治疗作用，并分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性10周龄BALB/c小鼠60只[许可证号：SYXK(陕)2012-005]，体重(17.0±0.5)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。每天观察小鼠基本情况，包括活动量、饮水量、进食量及体重。

1.2 主要试剂和仪器 乳酸菌MRS肉汤培养基；阿托伐他汀钙片(批号：20190731，齐鲁制药海南有限公司)；流式细胞检测仪(美国BD公司)；小动物超声仪(加拿大VISUALSONIC公司);恒温培养摇床(上海和呈仪器制造有限公司)；酶标仪(芬兰Labsystems公司);细胞培养箱(美国SHELLAB公司)。

1.3 实验分组 按随机法将小鼠分为模型组、对照组和实验组，每组20只。在实验开始，给予模型组和实验组干酪乳杆菌细胞壁成分(LCWE)0.5 mg腹腔注射，对照组给予0.9%氯化钠溶液0.5 ml。实验组在第5天口服阿托伐他汀(10 mg/d)，模型组和对照组均腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。LCWE制备：干酪乳杆菌常规培养于乳酸菌肉汤培养基中，经质谱仪鉴定为类干酪乳杆菌类干酪种，经过细菌培养、酶消化、超声破碎等步骤后进行LCWE提取，分别装在1.5 ml EP管中，-80 ℃保存备用。BALB/c小鼠经腹腔单次注射0.3 ml LCWE，连续2次，以诱导川崎病模型。

1.4 心脏高分辨超声心动图检查 用异氟烷气体麻醉小鼠后，将脱毛膏涂于左胸前区，1 min后用棉签擦拭干净。取仰卧位，胸部涂超声耦合剂，分别记录LCWE注射后4、14、28 d心脏超声检查结果，主要包括左、右冠状动脉的测量值。

1.5 心脏病理检查 小鼠做完心脏超声检查后立即处死，解剖心脏标本，行冰冻切片后HE染色，观察血管弹力纤维连续性变化。

1.6 实验室指标检测 把小鼠(每组8只)心脏组织打成组织匀浆，通过蛋白质印迹和电泳迁移率实验方法(EMSA)检测心脏组织核因子(NF)-κB表达量及活性，通过蛋白质印迹法和明胶酶谱法检测心脏组织基质金属蛋白酶(MMP)-9表达量及活性。试剂(批号：20200819、20200723)购于美国Proteintech公司。

2 结 果

2.1 小鼠行为学变化 在LCWE单侧腹腔注射1～2 h左右，部分小鼠出现毛发紊乱、易激惹、活动力下降，以及进食和体重等变化。在LCWE单侧腹腔注射12 h后，与对照组小鼠比较，模型组小鼠活动和进食量减少，部分出现发热、寒战。

2.2 小鼠超声心动图检查结果 见图1。LCWE腹腔注射后4 d，左冠状动脉主干内径增宽，约0.255 mm，内膜增厚，约0.105 mm。注射后15 d，冠状动脉明显增宽。注射后24 d，出现右冠状动脉瘤。阿托伐他汀治疗10 d后，左冠状动脉主干内径减小。

A：LCWE腹腔注射后4 d；B：LCWE腹腔注射后15 d；C：LCWE腹腔注射后24 d；D：阿托伐他汀治疗10 d后

2.3 小鼠心脏组织病理检查结果 模型组第15天，左心室内膜局部内皮细胞脱落，其上形成白色血栓，内膜及肌壁间局部偶见少数中性粒细胞浸润(图2A)；右冠状动脉管腔扩张及少量心肌细胞坏死崩解(图2 B、C)；冠状动脉管壁增厚，管腔狭窄，腔内可见白色血栓形成(图2D、E)；主动脉瓣、二尖瓣轻度肿胀，少数中性粒细胞散在浸润(图2F)；心外膜间质水肿，可见少量淋巴细胞浸润及纤维结缔组织弥漫轻度增生(图2G)；局部纤维结缔组织显著增生并伴有固体钙盐沉着(图2H)。实验组在阿托伐他汀干预10 d后，小鼠左心耳外膜局部可见多量淋巴细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞浸润，未见明显血管炎性反应及其他明显异常(图2I)。

A-H：模型组第15天小鼠心脏组织HE染色结果(A-E ×40，F、H ×20，G ×10)；I：实验组阿托伐他汀干预10 d后小鼠心脏组织HE染色结果(×200)

2.4 各组小鼠心脏组织NF-κB表达量及活性比较 见表1。模型组第14、28天NF-κB表达量高于对照组和实验组(均P<0.01)，实验组和对照组NF-κB表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组第14、28天NF-κB活性明显高于对照组和实验组(均P<0.01)，且实验组NF-κB活性明显高于对照组(P<0.05)。

表1 各组小鼠心脏组织NF-κB表达量及活性比较(μg/L)

2.5 各组小鼠心脏组织MMP-9表达量及活性比较 见表2。模型组第14、28天MMP-9表达量及活性高于对照组和实验组(均P<0.05)，实验组和对照组MMP-9表达量及活性比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组小鼠心脏组织MMP-9表达量及活性比较(μg/L)

3 讨 论

川崎病是一种急性自限性发热性出疹性疾病[7]。冠状动脉的损伤中，冠状动脉瘤的形成是最常见和最严重的并发症[8-10]。目前除了常规丙种球蛋白、阿司匹林、双嘧达莫为一线治疗方案外，临床上丙种球蛋白不敏感性川崎病、川崎病合并冠状动脉病变、冠状动脉瘤形成的诊治是常遇到的瓶颈问题。目前焦点主要在激素的选取上[11-13]。本实验分为两个部分：第一部分是川崎病小鼠造模相关研究，从实验情况看，给予腹腔注射LCWE免疫BALB/c小鼠来造模的方法是可取的；第二部分为阿托伐他汀的治疗探索问题，通过检测蛋白表达量及活性来判断阿托伐他汀对NF-κB和MMP-9的影响，观察阿托伐他汀的作用机制，为临床使用提供理论依据。

在整个实验操作过程中，给予小鼠LCWE注射后，我们通过小鼠的行为表现，超声、病理切片等检查发现，模型组与对照组相比，小鼠的行为学表现有明显差异，且超声提示冠状动脉内径增宽。模型组HE染色后，在冠状动脉局部可以看到炎性细胞浸润。而对照组病理检查结果未见明显异常。LCWE免疫所致小鼠模拟了川崎病冠状动脉损伤的病理过程，说明造模是成功的。同时，将实验组(阿托伐他汀治疗)和模型组对比发现，心脏标本HE染色显示冠状动脉局部炎性细胞浸润的严重程度明显减低。实验结果初步说明，阿托伐他汀治疗小鼠川崎病是有一定效果的。

本实验发现，对照组NF-κB和MMP-9在表达量和活性方面比较，差异无统计学意义，证明正常小鼠内NF-κB和(或)MMP-9的生理状态是稳定的。有研究[14-15]证实，在川崎病合并冠状动脉损伤患儿外周血中NF-κB高表达，表明NF-κB参与了其发病。此外，在川崎病合并冠状动脉病变的发病机制中，MMP-9作为血管重建因子也起了关键作用[16-17]。并且MMP-9与NF-κB关系紧密[18]。本实验结果提示，川崎病小鼠模型同样存在NF-κB和MMP-9的过度表达和激活，再次证实了两者在川崎病发病机制中的相互作用。另外，与模型组比较，实验组第14、28天心脏及冠状动脉组织NF-κB表达量减少，但与对照组比较差异无统计学意义，而NF-κB活性明显低于模型组，但高于对照组，说明阿托伐他汀可以抑制小鼠心脏组织NF-κB的过度表达与激活。给予小鼠腹腔注射LCWE后，MMP-9表达量和活性均出现上升，给予阿托伐他汀治疗后其过度表达和激活受到抑制，说明MMP-9作为NF-κB的下游因子，其表达量及活性的变化与NF-κB是一致的[19-21]。

综上所述，阿托伐他汀对小鼠川崎病具有一定的治疗效果，其作用机制可能是抑制川崎病小鼠模型NF-κB和MMP-9过度表达与激活，从而减少血管炎的发生。另外，本实验也存在一些不足之处：实验设计的时间过短，在数据收集的时间点覆盖不全，没有完全兼顾急性期及恢复期实验室数据的采集；在小鼠超声技术存在一定的技术局限，无法与病理进行逐一对比，后续将进行更为深入的研究。