Kod DNA聚合酶的制备及纯化研究

易芳 来鹏程 郑希鳌 胡帅 高燕丽

（浙江农林大学，杭州 311300）

在原核细胞和真核细胞DNA复制过程中，每聚合108-1010个核苷酸就会掺入一个错误配对的核苷酸，为保证DNA复制的准确性，细胞内复制型DNA聚合酶通过发挥校正错误配对核苷酸的能力而保证遗传信息的准确性［1］。自20世纪80年代，Mullis等［2］发明了聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术从而实现了DNA体外快速扩增，该技术的问世和发展对分子生物学研究领域具有划时代的意义。聚合酶链式反应（PCR）可看作是生物体外一种特殊的DNA复制方式，利用DNA聚合酶耐高温和核苷酸校准的特性，能将微量DNA以几何倍数的增加方式而达到百万倍扩增。因此在PCR技术应用过程中，DNA聚合酶发挥着至关重要的作用［1］。

最早应用于PCR反应的DNA聚合酶是由Escherichia coli（E. coli）DNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端具有605个氨基酸残基片段的Klenow酶，该酶具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，但不具有5'-3'外切酶活性［1，3-4］。由于Klenow酶在使用过程中存在不耐高温等缺陷，因此寻找具有优良特性的DNA聚合酶取代Klenow酶成为最适用PCR反应用酶的问题亟待解决。20世纪70年代，Chien等［5］从黄石国家公园温泉中的水生栖热菌（Thermus aquaticus）中成功分离出能在80℃稳定存在的DNA聚合酶-Taq酶。它具有能以单链DNA为模板合成互补DNA链，即使在97.5℃下仍能发挥最佳效果，且在72℃条件下，10 s内复制1 kb的DNA链等特性，这些优良特征使得DNA体外扩增成为了可能［6］。随后，以Taq DNA聚合酶活性为基础而发明的PCR和分子克隆技术逐渐成为扩增基因序列最重要的手段，并被广泛应用于基因工程、疾病诊断、法医鉴定等领域［2，7-9］。 即便如此，其在实际应用过程中仍受到一定限制，主要表现在其缺乏3'-5'外切核酸酶校正活性，致使其在扩增长片段DNA时容易掺入过多错误碱基致使PCR反应提前终止，导致常规PCR反应产物的长度受限于3 kb以下［4，10-11］。除Taq酶之外，与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ同源的DNA聚合酶（B型DNA聚合酶），因其具有3'-5'外切核酸酶校正活性和高保真性［12］，也广泛应用于PCR，例如从嗜热古细菌（Pyrococcus Kodakaraensis）中分离纯化得到的Kod高保真酶就属于这类具有强校准功能并且耐热性良好的DNA聚合酶［13］。与Taq DNA聚合酶相比，Kod聚合酶可更快更准确的达到PCR扩增效果，其扩增速度至少是Taq DNA聚合酶的2倍；同时由于其具有的3'-5'核酸外切酶活性（校正活性），可准确地对目的片段进行扩增，从而降低了PCR扩增过程中错误掺入核苷酸的机会［14］。

本研究通过对Kod DNA聚合酶表达和纯化的条件进行优化，来获得具有高效扩增能力的Kod DNA聚合酶，旨为探究分离纯化Kod DNA聚合酶提供一定的技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用蛋白原核表达菌种Rosetta（DE3）以及原核表达载体pET-30a-Kod均由浙江农林大学林业与生物技术学院智能实验楼N405实验室保存，市售商品化高保真酶Promega GoTaq®DNA Polymerase试剂盒（M7808）购于Promega公司。

PCR试验所用模板DNA提取于野生型拟南芥幼苗，试验需要扩增的基因为拟南芥液泡分选受体AtVSR6基因组DNA（AT1G30900），片段长度为3 194 bp，该基因引物由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 Kod DNA聚合酶的诱导表达 将pET-30a-Kod质粒热激转化至蛋白原核表达菌株Rosetta（DE3）中，37℃复性1 h后涂布于含氨苄霉素（100 mg/mL）的固体LB平板上37℃过夜生成菌落，利用菌落PCR挑选出阳性单克隆并接种于含氨苄霉素的LB液体培养基中37℃，250 r/min培养至OD600介于0.6-0.8之间，加入不同浓度的诱导剂IPTG（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L），置于28℃恒温摇床，250 r/min培养16-18 h后，取出100 μL菌液加入5×SDS上样缓冲液，100℃加热10 min使菌株破碎变性，12 000 r/min离心1 min，取20 μL上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析。

1.2.2 Kod DNA聚合酶的提取 将50 mL培养16-18 h的pET-30a-Kod菌 液4℃ 6 000 r/min离 心15 min，去上清收集菌体；加入提前预冷的10 mL裂解液（4 mg/mL Lysozyme，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）重悬菌体；在冰浴条件下使用超声破碎仪破碎菌液直至菌液清澈（超声27 s，间隙3 s，输出功率15%），将清澈菌液4℃ 10 000 r/min离心30 min并收集上清，即为Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），将Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）置于75℃烘箱1 h，去除不耐热的杂蛋白，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至新的15 mL离心管中，并将其置于冰上，用等体积1×PBS重悬浮沉淀，即残渣重悬液（CMKod）。

1.2.3 Kod DNA聚合酶的纯化及优化 预先用1×PBS洗涤Ni-NTA柱，750 r/min离心30 s，再将Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）加入Ni-NTA柱，每次600 μL，750 r/min离心30 s，收集洗脱液上清；再次使用1 × PBS洗涤Ni-NTA柱5次，最后在Ni-NTA柱中加入含有不同浓度咪唑（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L）的洗脱缓冲液（50 mmol/L KCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0），静置30 s，4℃ 750 r/min离心30 s并收集洗脱液，即为纯化后的Kod DNA聚合酶。

剪取10 cm透析膜袋，用ddH2O浸润，并用夹子对透析膜一端进行封口；将包含Kod DNA聚合酶的洗脱缓冲液加入透析膜袋中，并将其置于装有储藏缓冲液（0.1 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，50% Glycerol，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）的烧杯中，置于4℃并利用磁力搅拌器缓慢搅拌，4 h后置换储藏缓冲液，过夜透析12 h后，将透析膜中的溶液转移至1.5 mL离心管中，加入5 μL MgCl2（1 mol/L）和10 μL DNase I（10 U/μL），置于37℃培养箱中孵育20 min；70℃加热10 min，使DNase I失去活性，14 000 r/min离心5 min；取上清液至新的1.5 mL离心管，并用储藏缓冲液1∶1稀释，即Kod DNA聚合酶原液，-80℃保存。

取20 μL Kod DNA聚合酶原液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并用考马斯亮蓝染色分析Kod DNA聚合酶的浓度。

1.2.4 Kod DNA聚合酶的活性检测 利用PCR分析自提纯化的Kod DNA聚合酶的活性。PCR反应体系总体积为25 μL，反应组成为：2.5 μL野生型拟南芥基 因 组DNA，12.5 μL 2 × PCR buffer，2.5 μL BSA（1 mg/mL），1 μL上 下游 引 物（10 μmol/L，表1），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL不同浓度自提纯化的Kod DNA聚合酶，同时以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作为对照，最后ddH2O补足25 μL。

表1 PCR扩增引物信息Table 1 Information of the primers used for PCR

PCR反应参数设置为95℃预变性3 min；95℃变性15 s；58℃退火15 s；72℃延伸时间根据模板长度而定（≤1 kb设置为1 min，≤2 kb设置为2 min）；30次循环；72℃延伸5 min。PCR结束以后使用1%琼脂糖凝胶电泳分析不同浓度Kod DNA聚合酶的扩增效果。

2 结果

2.1 不同浓度诱导剂IPTG对Kod DNA聚合酶表达的影响

利用不同浓度IPTG（0.1 mmol/L和0.2 mmol/L）对Kod DNA聚合酶诱导表达，通过酶溶法和超声波破碎法从重组大肠杆菌中收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）。经SDS-PAGE电泳，结果显示，所得蛋白质分子大小为90 kD，与前人所研究的酶蛋白大小一致，表明成功诱导Kod DNA聚合酶表达［13］。透析后所得Kod DNA聚合酶酶原液经储藏缓冲液1∶1稀释后的结果显示，0.1 mmol/L和0.2 mmol/L IPTG均可诱导Kod DNA聚合酶表达（图1）。由于IPTG对菌体有一定的毒性，因此在后续的实验中选用终浓度为0.1 mmol/L的IPTG对Kod DNA聚合酶进行诱导表达。

图1 不同浓度诱导剂IPTG对Kod DNA聚合酶表达的 影响Fig.1 Effects of different concentrations of IPTG on the expressions of Kod DNA polymerases

2.2 不同浓度咪唑对Kod DNA聚合酶纯化的影响

经酶溶法和超声波破碎后的Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）通过Ni-NTA纯化时，设置含有不同浓度咪唑的洗脱缓冲液（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L），以探究洗脱液中咪唑的最佳浓度。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色结果显示，当同等体积洗脱液过柱洗脱时，含有200 mmol/L和500 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱所得Kod DNA聚合酶产量较高（图2）。因此，含有200 mmol/L咪唑的洗脱液可应用于纯化Kod DNA聚合酶。

图2 不同浓度咪唑对Kod DNA聚合酶纯化的影响Fig.2 Effects of different concentrations of imidazole on the purifications of Kod DNA polymerases

2.3 条件优化后Kod DNA聚合酶的制备效果

根据上述试验结果显示，确定Kod DNA聚合酶提取纯化的最佳条件为：使用终浓度为0.1 mmol/L IPTG在28℃条件下诱导菌体16-18 h，4℃条件下离心并收集菌体；加入裂解液重悬菌体；并使用超声波破碎仪破碎，收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），利用Ni-NTA吸附Kod DNA聚合酶，最后使用含有200 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱收集纯化后的Kod DNA聚合酶。按照此优化步骤，增大诱导菌量对Kod DNA聚合酶进行提取纯化，SDS-PAGE结果显示，使用上述优化条件可制备高纯度且高产量的Kod DNA聚合酶（图3）。最后采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准对照，即50 mL重组大肠杆菌中，可提取约2.5 mg Kod DNA聚合酶蛋白。

图3 优化条件后Kod DNA聚合酶的制备效果Fig.3 Preparation effect of Kod DNA polymerase after comprehensive optimization conditions

2.4 Kod DNA聚合酶活性检测

2.4.1 Kod DNA聚合酶反应体系中酶的浓度及Mg2+浓度对目的基因扩增的影响 判断DNA聚合酶制备成功与否主要在于验证其是否具有聚合酶的活性，因此本研究通过PCR反应来检测自提纯化的Kod DNA聚合酶活性，并以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作为对照。为进一步优化Kod DNA聚合酶的扩增效率，探究了PCR反应体系中Kod DNA聚合酶浓度及Mg2+浓度对目的基因扩增的影响。根据1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，自提纯化的Kod DNA聚合酶浓度介于0.061 25-0.5 μg/μL均可有效扩增出AtVSR6基因（3 194 bp），而PCR反应体系中不同Mg2+浓度（1.5 mmol/L、1.75 mmol/L、2.0 mmol/L、2.25 mmol/L）对整个PCR扩增效率无显著影响（图4）。

图4 Kod DNA聚合酶PCR反应体系中酶浓度及Mg2+浓度对目的基因扩增的影响Fig. 4 Effects of enzyme content and Mg2+ concentration on target gene amplification in Kod DNA polymerase reaction system

2.4.2 Kod DNA聚合酶的保真性 Kod DNA聚合酶作为高保真酶，对于长片段的有效扩增及碱基的低错配率（高保真酶的保真性）是衡量其是否成功制备的重要依据。PCR反应体系中酶含量为0.061 25 μg/μL，Mg2+浓度为1.5 mmol/L，以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶为对照。

根据1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，Kod DNA聚合酶能有效地扩增出长度为3 194 bp大小的AtVSR6的目的条带（图5-A）。Sanger测序结果显示，扩增片段与GenBank数据库中AtVSR6基因序列完全匹配（图5-B和C）。因此，自提纯化的Kod DNA聚合酶扩增效率和保真性与所选商用酶相当。

图5 Kod DNA聚合酶的保真性验证Fig.5 High-fidelity verification of Kod DNA polymerases

3 讨论

DNA聚合酶是负责生物体内DNA复制和DNA损伤修复所必需的酶，在遗传信息传递过程中发挥着不可或缺的作用。随着对DNA聚合酶的研究越来越多，其相关的制备条件也在不断优化发展，其中DNA聚合酶分离纯化的方法主要有硫酸铵沉淀 法［15-17］、Ni柱亲和色谱法［18］、AKTA蛋白纯化系 统［19］及冻溶法［17］等，这些方法均旨在提高酶的表达量、特异性以及酶活力等［19］。

蛋白质的表达可分为原核表达和真核表达，与真核表达相比，原核表达系统以能在短时间内获得大量基因表达产物，方法简单且所需的成本低廉等优点而被广泛使用［20-21］。在原核蛋白表达过程中，通常在目的蛋白的N端或C端连接标签蛋白，这使得后期蛋白纯化变得更加便利，其中His标签蛋白是一种较为广泛使用的重组蛋白标签，其特性是分子质量小，对表达的重组蛋白可通过金属离子亲和层析进行纯化［22-24］。本研究中Kod DNA聚合酶所使用的表达载体pET-30a带有His标签，由于其分子量小的特点，对于后期蛋白活性没有显著影响，并且在诱导物IPTG存在时可诱导Kod DNA聚合酶蛋白大量表达［25］。不同重组蛋白在进行蛋白诱导表达时所需的IPTG浓度各有差异［26］。本研究探究了不同IPTG浓度对Kod DNA聚合酶诱导表达的影响。由于高浓度的IPTG对菌体具有一定毒性，诱导表达时会导致菌体中形成大量包涵体，而以包涵体形式存在的蛋白分子不具有正确的生理结构及生物活性，最终导致可溶性蛋白表达量减少［27-29］。本实验中使用两种浓度IPTG诱导表达Kod DNA聚合酶，发现使用0.1mmol/L IPTG即可诱导Kod DNA聚合酶高效表达，故选择IPTG终浓度为0.1 mmol/L作为最优的表达条件。

His标签是由6个组氨酸残基构成，组氨酸侧链的咪唑基能与固定化的镍、铁、铜等金属离子以配位键形式结合，而高浓度的咪唑能通过竞争性结合使蛋白从Ni柱解离，这种特性促使His标签广泛应用于蛋白分离纯化［30-31］。本研究中利用不同浓度咪唑与带His融合蛋白标签的高保真DNA聚合酶竞争性结合Ni2＋，从而洗脱结合到Ni-NTA柱上的Kod DNA聚合酶，发现高浓度咪唑会洗脱大量非特异性蛋白，低浓度咪唑则会降低洗脱蛋白产量。因此本研究探究了不同浓度咪唑对洗脱效率的影响，发现洗脱液中咪唑浓度为200 mmol/L时，洗脱得到的Kod DNA聚合酶较多，同时杂质蛋白较少，洗脱效果最好。由于在纯化DNA高保真聚合酶过程中，会引入一定量的菌体DNA，因此在进行PCR试验时这些菌体自带DNA可能会污染PCR结果，从而干扰试验［32］。因而在Kod DNA聚合酶纯化过程中，如何去除菌体自带DNA的方法也具有重要的探究价值。

自提纯化的Kod DNA聚合酶能有效扩出增长达3 194 bp清晰的目的片段，这可能与其具有3'-5'外切酶校正活性有关，且经Sanger测序及序列比对证实自提纯化的Kod DNA聚合酶具有优良的扩增能力和保真性。由此可见，本研究所提取纯化的Kod DNA聚合酶的作用效果与商业化高保真DNA聚合酶效果相当，对今后实验室自主制备DNA聚合酶提供一定的借鉴思路。

4 结论

本研究利用酶溶法和超声波破碎法对0.1 mmol/L IPTG诱导表达的Kod DNA聚合酶菌株破碎，利用含咪唑浓度为200 mmol/L洗脱液经Ni-NTA柱分离纯化后，成功透析制备出Kod DNA聚合酶原液，最终50 mL pET-30a-Kod菌液获得约2.5 mg蛋白，即每毫升菌液可获得约0.05 mg Kod DNA聚合酶。当PCR反应体系中Mg2+浓度为1.5 mmol/L，Kod DNA聚合酶浓度为0.061 25 μg/μL时，能有效地扩增出目的条带，且Kod DNA聚合酶的酶活性和扩增准确性均能达到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究为节省实验室PCR成本，进一步开发和利用Kod DNA聚合酶奠定了一定的基础。