Lon1蛋白酶参与耐辐射异常球菌高温胁迫及细胞分裂的功能研究

赵明明 唐殷 郭磊周 韩佳慧 葛佳茗 孟勇 平淑珍 周正富 王劲

（1. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2. 绵阳禾本生物工程有限公司，绵阳 621011）

细菌面对外界环境刺激如干旱、高低温、盐胁迫以及营养物质匮乏时，细胞内的蛋白会遭受损伤，发生错误折叠以及变性聚集，最终造成蛋白质稳态失衡，对细胞造成不可逆的伤害［1］。为了维持胁迫条件下的生长和繁殖，细胞的首要任务即高效的去除错误折叠及变性的蛋白，或者帮助错误折叠蛋白恢复至天然构象，最终使蛋白水平恢复稳态。在这一过程中，与多种细胞活性相关的（ATPases associated with various cellular activities，AAA+）胞内水解酶发挥着重要作用［2］。

Lon蛋白酶是第一个被纯化和研究的AAA+蛋白酶，广泛存在于细菌、古菌、真菌以及真核生物的细胞器中［3］。根据Lon蛋白酶氨基酸序列的同源性和结构特征，可将Lon蛋白分为两类，即存在于大部分细菌中的LonA和主要存在于古细菌中的LonB。LonA类蛋白酶主要由3个结构域组成，分别为参与底物识别的N端结构域、负责ATP结合与水解的ATP酶结构域以及含有Ser-Lys二联体的酶活中心。其中ATP酶结构域为Lon蛋白酶发挥酶活性提供能量，酶活性中心使Lon具有蛋白水解能力。LonB缺少N端结构域，但是在ATP酶结构域中插入了一段跨膜区［4］。在水解蛋白质的过程中，Lon蛋白酶首先识别并结合底物蛋白，再通过ATP的水解使得底物蛋白打开二级结构，最终底物蛋白以一级结构的方式被运输到蛋白水解腔中进行水解［5］。

Lon蛋白酶的主要功能是水解损伤蛋白。有研究显示，大肠杆菌中约50%的异常蛋白由Lon负责水解，Lon蛋白酶还能通过水解多种调节蛋白参与DNA修复、细菌毒力、耐药性、胁迫抗性、形态等多个生理学过程［6］。例如，Jonas等［7］发现高温胁迫可诱导新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）Lon蛋白酶的合成，从而水解负责DNA复制的启动蛋白DnaA，抑制细菌的DNA复制，最终提高菌株的高温胁迫抗性；Lon的缺失使大肠杆菌形成长线型、不可分裂的细丝状表型［8-9］。而Breidenstein等［10］发现lon基因的突变可影响铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）三型分泌系统相关基因的表达，从而使其毒力减弱。Kim等［11］的研究表明Lon蛋白酶可水解沙门氏菌（Salmonella enterica）铁离子输入蛋白FeoC，调控细菌在胁迫环境下铁离子平衡。

耐辐射异常球菌作为迄今为止发现的最具辐射抗性的微生物之一，具有超强的抵御极端环境的能力，因此往往作为研究非生物胁迫抗性机制的模式生物［12-13］。有研究显示耐辐射异常球菌的极端抗性可归因于其拥有功能强大的胞内蛋白质稳态系统［14］。前期分析发现高温胁迫2 h后，耐辐射异常球菌中的编码Lon蛋白酶同源物的基因dr_1974（lon1）转录水平显著上调，可能在菌株高温胁迫中发挥重要作用。本研究以耐辐射异常球菌的Lon1蛋白酶为研究对象，通过突变株构建、抗逆功能比较、蛋白质组分析对耐辐射异常球菌的Lon1功能进行探讨，为解析耐辐射异常球菌的极端抗逆机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及培养条件 供试菌株和质粒见表1。耐辐射异常球菌于TGY培养基中30℃培养，大肠杆菌于LB培养基中37℃培养。突变株和回补株分别添加相应抗生素。

表1 菌株与质粒Table 1 Strains and Plasmids

1.1.2 主要试剂 本实验使用的细菌基因组提取试剂盒购自北京聚合美有限公司，常规质粒提取试剂盒和胶回收纯化试剂盒购自Magen公司，RNA提取试剂盒购自Pronega公司，RNA反转试剂盒购自TaKaRa公司，荧光定量PCR试剂及高保真酶2×Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞公司，其它生化试剂均为分析纯。实验涉及的引物合成由生工生物完成，测序由华大生物技术公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 从NCBI数据库中获取lon1的氨基酸序列，使用功能域预测网站http：//smart.embl-heidelberg.de/对Lon1蛋白进行功能域分析。通过NCBI进行耐辐射异常球菌Lon1同源蛋白的查找，利用ClustalW对耐辐射异常球菌Lon蛋白进行氨基酸序列比对，用NJ法建立系统发育树。并用bootstrap法（重复1 000次）评估系统发育树。

1.2.2 lon1的转录水平分析 高温、氧化、UV和盐胁迫处理及菌体收集参考刘盈盈［15］方法。提取上述菌体的RNA，并消化反转为cDNA，利用qRTPCR分析lon1在不同非生物胁迫条件下的转录水平。RNA的提取步骤参考RNA提取试剂盒TRIzolTMPlus RNA Purification Kit说明书，RNA中DNA的去除及反转参考TaKaRa公司的试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书进行，qRT-PCR程序参考刘盈盈［15］。

1.2.3 lon1突变株及回补株的构建 本研究利用同源重组方法在靶标基因中插入抗性基因，完成lon1功能缺失突变株构建，所用引物如表2。以D. radiodurans R1基因组为模板，用lon1-Up-F/R引物扩增lon1的上游序列，用lon1-Down-F/R引物扩增lon1的下游序列，以pKatA PH3为模板，用Kan-F/R引物扩增带有启动子的卡纳霉素抗性基因片段。通过同源重组将3个片段进行连接，构建融合片段Ulon1-Km-Dlon1。利用同源重组的方法转化到D. radiodurans R1野生型中获得突变株△lon1［16］。扩增lon1及上游启动子区连接pRADZ3载体构建重组载体pZ3-lon1，转化至△lon1中，构建lon1基因的回补菌株comlon1，同样的方法将pRADZ3质粒转化△lon1获得Z3-△lon1。

表2 引物序列Table 2 Sequences of Primers

1.2.4 正常培养条件下生长曲线测定 活化D. radiodurans R1野 生 型、突 变 株△lon1、回 补株comlon1以及Z3-△lon1，将种子液按照起始OD600=0.1分别转接于20 mL新鲜的TGY液体培养基中，于30℃ 220 r/min连续震荡培养，期间每隔4 h取样1次，测定样品在OD600时的吸光值，连续测定至细菌生长稳定后期（约48 h）。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制正常培养条件下的生长曲线，每个菌株设3个重复。

1.2.5 蛋白质组测定 活化耐辐射异常球菌野生型WT、△lon1，按1%转接到300 mL新鲜TGY液体培养基中，30℃摇床培养至对数初期（菌液OD600=2）。各取150 mL菌液8 000×g离心10 min收集菌体作为对照组（CK），将剩余的菌液置于48℃的摇床中220 r/min培养2 h后离心收集菌体作为胁迫处理组。将收集的菌体液氮速冻，利用非标定量法（label-free）技术进行蛋白组学测定分析。

1.2.6 扫描电镜与透射电镜观察lon1缺失对细胞形态的影响 离心收集50 mL OD600=0.6-0.8的菌体，将菌体重悬在2.5%的戊二醛中并室温固定24 h，然后经过一系列漂洗与脱水，最终将菌体包埋在2%的树脂中并切片，然后用透射电镜和扫描电镜观察不同菌株的形态。其中透射电镜为日本HITACH公司的H-7500，扫描电镜为日本HITACH公司的S-570。

1.2.7 耐辐射异常球菌非生物胁迫实验 胁迫方法参考1.2.2，胁迫处理完成后用灭菌磷酸缓冲液PBS（pH 7.0）对进行倍比稀释（10-1-10-5），每个稀释度各取8 μL点在固体TGY培养基表面，经30℃培养约2-3 d后，观察菌落形成情况。

2 结果

2.1 Lon1的生物信息学分析

Lon1（DR_1974）位于D. radiodurans的I号染色体上（NC_001263.1），碱基全长为2 442 bp，编码 813个氨基酸，预测蛋白分子量约为93 kD。功能域预测发现，耐辐射异常球菌的Lon1蛋白酶具有负责底物识别的N端结构域，而无跨膜区，具有A类Lon蛋白酶的典型特征（图1-A），表明耐辐射异常球菌的Lon1蛋白为A类Lon蛋白酶。

将Lon1的氨基酸序列在GenBank中进行比对BlastP搜索，并选取具有代表性的细菌的Lon氨基酸序列构建系统发育树。结果如图1-B所示，除Deinococcus属以外，耐辐射异常球菌Lon1与Marinithermus hydrothermalis的亲缘关系较近。

图1 Lon1结构域及系统发育分析Fig. 1 Structural domain and phylogenetic analysis of Lon1

2.2 lon1的转录受高温诱导

为了研究不同非生物胁迫条件下耐辐射异常球菌野生型菌株中lon1基因的表达情况，本研究通过qRT-PCR分析了在高温胁迫（48℃）、UV辐射、盐胁迫以及过氧化氢胁迫条件下lon1转录水平的变化。结果如图2所示，48℃高温冲击不同时间（1、2、3、4和5 h），lon1（dr_1974）的转录水平量均显著提高，其中在冲击3 h时转录水平上调倍数最高，约上调了27倍，随着冲击时间的延长，lon1的转录水平逐渐下降直至恢复至冲击前水平（图2-A）。同时分析了lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl胁迫条件下的转录变化，结果显示相较于高温胁迫，lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl胁迫条件下的转录水平变化倍数较小（图2-B、C、D）。以上结果说明lon1受高温胁迫诱导，可能在耐辐射常球菌的高温胁迫适应中发挥重要作用。

图2 荧光定量PCR分析不同胁迫条件下lon1基因的转录变化Fig. 2 Transcriptional analysis of lon1 gene under different stress conditions by qRT-PCR

2.3 lon1突变株及回补株的构建及验证

通过同源重组技术获得lon1基因上游、卡那霉素抗性盒及lon1基因下游3个片段的融合产物lon1 U-Kan-D，经测序验证后热击转化至耐辐射异常球菌野生型中。在含有卡那霉素的平板上筛选阳性克隆，并利用PCR扩增与测序验证获得正确的突变株△lon1，通过qRT-PCR测定了lon1基因缺失对上下游基因转录的影响。从图3-A中可以看出，lon1基因上游为clpP和clPX基因，分别编码AAA+蛋白酶ClpXP的两个亚基，ClpXP蛋白酶也是细胞水解系统的重要组成部分；lon1下游的dr_1975和dr_1976分别编码N-乙酰基转移酶和核酸内切酶；从图3-C中可以看出，lon1的缺失对其上下游基因的转录无影响。在此基础上通过构建重组质粒并转化△lon1的方式获得回补株comlon1和对照菌株Z3-△lon1。正常培养条件下的生长曲线测定（图4）发现，lon1的缺失和回补以及pRADZ3质粒均不影响耐辐射异常球菌的生长。

图3 lon1突变株的构建与验证Fig. 3 Construction and identification of the lon1 mutant strain

图4 正常培养条件下菌株D. radiodurans、△lon1、com lon1和Z3-△lon1的生长Fig. 4 Growth of D. radiodurans，△lon1，com lon1 and Z3-△lon1 in normal culture condition

2.4 lon1的缺失导致菌株对高温和盐胁迫敏感

为了确定lon1基因是否与耐辐射异常球菌响应极端环境有关，分析了耐辐射异常球菌野生型R1、突变株△lon1和回补株comlon1在48℃高温胁迫、NaCl胁迫、UV辐射以及不同浓度过氧化氢处理30 min条件下的生长情况。结果（图5）显示，相较于野生型菌株R1，48℃高温胁迫5 h使△lon1的存活率下降一个数量级，且lon1的回补能够使菌株恢复至与野生型同样的生长状态，这说明lon1与耐辐射异常球菌的高温胁迫抗性相关；除此之外，本研究发现0.2 mol/L的NaCl胁迫条件下，菌株△lon1的生长受到严重影响，其存活率比野生型降低约4个数量级，因此lon1在耐辐射异常球菌的盐胁迫下发挥更为重要作用。但在过氧化氢胁迫及UV胁迫条件下，△lon1的存活并未受到严重影响，其生长状态与野生型菌株相比未见巨大差异。

图5 高温、NaCl、H2O2以及UV胁迫对不同菌株生长的影响Fig. 5 Growth of different strains upon high temperature，NaCl，H2O2 and UV stresses

2.5 高温胁迫条件下耐辐射异常球菌野生型及△lon1的蛋白组分析

48℃胁迫2 h 后，相较于野生型菌株，△lon1中共有31个蛋白发生显著差异，其中25个蛋白表达水平发生显著上调（P＜0.05，FC＞1.5），6个蛋白水平发生显著下调（P＜0.05，FC＜0.667）。如表3所示，显著上调表达的蛋白主要包括分子伴侣DnaK、GroEL、ClpB、GroS、GrpE，此外参与DNA修复、转录调控、能量代谢以及膜功能和转运相关的蛋白表达量也发生了显著上调，而参与氨基酸代谢和翻译的相关蛋白表达量显著下调。值得注意的是，5个与细胞形态建成相关的蛋白表达量显著下调，这说明在响应高温胁迫的过程中，Lon1 参与一个广泛的蛋白调控网络，且Lon1可能与耐辐射异常球菌的细胞形态相关。

表3 与lon1有关的响应高温胁迫的差异表达蛋白Table 3 Differentially expressed proteins associated with lon1 in response to high temperature stress

2.6 Lon1的缺失影响菌株的细胞形态

由于蛋白组数据显示正常生长条件下lon1基因缺失使5个细胞形态相关的蛋白发生差异表达，本研究利用扫描电镜和透射电镜观察野生型菌株DR、△lon1以及comlon1的细胞形态，结果如图6所示，从图6-A中可以看出lon1基因缺失后，耐辐射异常球菌的细胞形态异常，不再呈典型的四分体或二分体结构，而是呈串状聚集，并且中间黑色的肽聚糖层显著变薄，细胞膜出现明显损伤，细胞外膜出现弥散，有碎片物质从细胞表面分离。图6-B扫描电镜结果显示突变株△lon1的细胞体积显著大于野生型细胞，形成巨型细胞且lon1的缺失使其向细胞表面分泌大量物质，而lon1基因的回补能够使菌株恢复正常的形态。从以上结果可以看出，在耐辐射异常球菌中，lon1参与细胞形态以及分裂过程。

图6 耐辐射异常球菌野生型DR、△lon1以及comlon1的电镜图Fig. 6 Electron microscopy images of WT D. radiodurans DR，△lon1 and comlon1

3 讨论

耐辐射异常球菌能够在多种极端环境下存活的原因是能够在胁迫条件下最大程度维持细胞内蛋白质的稳态［13］。在此基础上进一步的研究显示耐辐射异常球菌的蛋白水解酶种类丰富且水解活性 强［14，17］。Lon作为一种重要的蛋白水解酶，在多种细菌胁迫响应过程中发挥至关重要的作用。耐辐射异常球菌dr_1974（lon1）基因编码一个Lon蛋白酶同源物，进化分析显示除了Deinococcus外，Lon1与嗜热菌的亲缘关系最近。此外qRT-PCR结果显示lon1的转录受高温诱导。高温主要造成蛋白质变性损伤，但由于细胞本身并不能识别温度的变化，因此高温胁迫响应往往是由损伤蛋白的聚集所触发的［18］，因此Lon蛋白酶表达受到高温胁迫调控极有可能是适应高温的进化结果。以上结果说明耐辐射异常球菌 Lon1可能在高温胁迫中发挥作用。

在遭受高温等非生物胁迫时，细胞除了利用胞内蛋白水解酶高效的清除变性受损蛋白外，同时也会通过分子伴侣蛋白对变性受损以及错误折叠的蛋白进行选择性修复［19］。分子伴侣多为热休克蛋白，高温可诱导其大量表达，其主要功能是帮助蛋白恢复至天然构象［20］，因此分子伴侣同样是维持蛋白质稳态的重要组成部分。高温条件下蛋白组结果显示，lon1的缺失引起多个分子伴侣蛋白含量显著升高，说明这些分子伴侣受高温诱导大量表达，同时这些分子伴侣可能是Lon1的水解底物，lon1的缺失影响了这些分子伴侣的水解，因此表现为表达量的显著上调。除此之外，Lon蛋白酶可能通过水解多种天然调控蛋白参与多个生物学过程［6］，本研究的蛋白组结果显示，lon1的缺失使DNA修复、转录调控以及膜功能与转运相关蛋白的表达量显著上调等。这说明高温胁迫条件下耐辐射异常球菌Lon1参与一个广泛的蛋白调控网。

lon基因突变还会导致多种表型，例如大肠杆菌（E.coli）和根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）lon的缺失使菌体呈长线型且对紫外敏感［8，21］；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）lon的缺失造成细菌运动能力明显缺陷，分裂过程异常［22］。透射电镜和扫描电镜观察结果显示，lon1的缺失使耐辐射异常球菌分裂异常，不再呈现典型的四分体或二分体结构，而是以串状形式聚集，形成巨型细胞，并且细胞膜受损严重。蛋白组差异蛋白中的细胞形态相关蛋白MurB、MurC、MurD、MurE都是细胞膜组分肽聚糖合成途径中的关键酶［23］，这可能是lon1的缺失使细胞膜完整性下降的主要原因，而lon1的缺失使耐辐射异常球菌对NaCl敏感则可能是细胞膜受损造成的。

对于Lon蛋白酶缺失造成的细胞分裂异常也有诸多报导，文献显示大部分细菌细胞分裂受抑制基因sulA的调控，该基因的产物可以抑制细胞分裂相关蛋白FtsZ的表达来阻止细胞分裂，以防止母细胞的染色体畸变遗传［24］。进一步的研究显示SulA蛋白为Lon的底物，在正常生长条件下，SulA的表达受到抑制，且SulA可被Lon正常降解［25］，其胞质浓度很低。当非生物胁迫造成DNA损伤时，可诱导SulA的表达，其胞质浓度显著增加。此时，SulA通过与FtsZ结合阻止细胞分裂，在DNA修复后，Lon水解SulA使其胞质浓度恢复至正常水平，细胞分裂逐渐恢复正常［4］。因此在Lon缺失条件下，SulA浓度将会长期处于较高水平进而影响细胞分裂。本研究中lon1的缺失虽然使细胞分裂出现了异常，但同源比对发现耐辐射异常球菌中并没有SulA同源物，因此耐辐射异常球菌Lon参与细胞分裂的途径还需要进一步深入研究。

4 结论

耐辐射异常球菌lon1的转录受高温诱导，在响应高温胁迫的过程中参与DNA修复、转录调控、膜功能与代谢等多个生物学过程。除此之外，lon1的缺失虽不影响菌株的生长，但却使细胞分裂异常，形成巨型细胞，细胞膜受损严重。lon1的缺失使耐辐射异常球菌对高温胁迫和盐胁迫敏感。