河南省和湖北省部分地区鸡球虫分离株对地克珠利耐药性调查

耿天天,叶 成,雷振宇,申 邦,,方 瑞,胡 敏,,赵俊龙,,周艳琴,*

(1.华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；2.湖北省预防兽医学重点实验室，湖北武汉 430070)

鸡球虫病是一种或者多种艾美耳球虫共感染于禽类肠道的禽病，当前控制鸡球虫病主要是通过在饲料里添加抗球虫药[1]，随之而来的鸡球虫耐药性问题始终困扰着养禽业的发展[2]。河南省和湖北省是禽类养殖大省，其中河南省2018年禽蛋产量为413.61万吨，湖北省为171.53万吨，2016年河南省家禽出栏量为93 420万只，湖北省为52 105.9万只。面对规模如此之大的养鸡产业，保证产蛋率和出肉率的稳定是一项巨大工程，因此把好鸡球虫病的防控关，其重要性不言而喻。地克珠利作为一种目前较为常用的抗球虫药[3]，监测其在该地区的耐药现状具有重要的现实意义。本研究中，河南11个地区和湖北11个地区的鸡球虫地方分离株作为研究对象，以最适抗球虫活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)、病变积分减少率(reduction of lesion scores，RLS)、相对卵囊产量(relative oocyst production，ROP)和抗球虫指数(anticoccidial index，ACI)4项指标综合评价[4]各虫株对地克珠利的耐药性，以对该地区的用药提供重要的参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 所用的动物均为白羽肉鸡，雏鸡于1日龄购自湖北省荆州市正康饲料有限公司，后转饲于华中农业大学野芷湖鸡房。

1.1.2 虫株 所用的虫株保存于华中农业大学寄生虫实验室，具体虫种见表1和表2。

1.1.3 药物和主要试剂 所用的地克珠利，由上海兽医研究所提供。重铬酸钾(分析纯)，天津市标准科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 HITACHI高速冷冻离心机，日本日立公司产品。

1.2 方法

1.2.1 球虫虫种的扩繁 将每株球虫分离株分别作为一组，每组5只鸡进行口服感染孢子化卵囊，收集感染后7 d和8 d的粪便，采用饱和食盐水漂浮法进行分离保种，而后于28.6 ℃培养箱进行孢子化培养，待其80%完成孢子化后将虫株保存于4 ℃备用。

1.2.2 鸡体笼养试验分组 将1日龄的白羽肉鸡饲养至13日龄，称重后淘汰体重过轻或者过重的鸡，而后对每只鸡进行编号分组，耐药性试验共分为3组：感染用药组，感染不用药组以及不感染不用药组(即为空白对照组)，并于13日龄开始于感染用药组给药0.2 g/kg，14日龄称重作为初始体重，并于当日进行攻虫，攻虫剂量为每只鸡0.5×104个卵囊，21日龄称重作为终末体重，并收集感染后6 d～7 d的粪便，进行卵囊计数；在21日龄将鸡只处死取鸡肠道，观察并记录肠道病变计分。

1.2.3 耐药性评价 以最适抗球虫活性(POAA)、病变积分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)以及抗球虫指数(ACI)对地克珠利进行耐药性评价，在4项指标中，1项指标为阳性，则表明其为轻度耐药，2项指标为阳性时，则表明其为中度耐药，3项和4项指标为阳性时，则表明其为高度耐药。

最适抗球虫活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)% =(感染用药组增重-感染不用药组增重/不感染不用药组增重-感染不用药组增重)×100%

最适抗球虫活性(percent of optimum anticoccidial activity，POAA)≥50%为敏感，<50%为耐药。

病变积分减少率(reduction of lesion scores，RLS)=(感染不给药组的平均病变值-感染给药组的平均病变值)/感染不给药组的平均病变值 ×100%

病变积分减少率(reduction of lesion scores，RLS)≥ 50%为敏感，<50%为耐药。

相对卵囊产量(relative oocyst production，ROP)= 感染给药组卵囊总数/感染不给药组卵囊总数×100%

相对卵囊产量(relative oocyst production，ROP)<15%为敏感，≥15%为耐药。

抗球虫指数(anticoccidial index，ACI)=(相对增重率+存活率)-(病变分值+卵囊值)

相对增重率(%)=感染用药组的品均增重/不感染不用药的平均增重×100%

存活率(%)=试验结束时鸡只数/试验开始时鸡只数×100%

卵囊值，按角田清[5]克粪便卵囊数(oocysts per gramme，OPG)值的方法进行

病变分值 = 平均盲肠病变积分(0～4)×10

卵囊比数(%)=不感染对照组或感染用药组卵囊数/感染不给药组卵囊数×100%

抗球虫指数(anticoccidial index，ACI)≥160，判为阴性；抗球虫指数(anticoccidial index，ACI)≤160，判为阳性[6]。

2 结果

通过以上4项指标对每一株分离虫株的综合评价，从表1和表2的结果可以看出，在河南省34株分离虫株中，有1株对地克珠利轻度耐药，4株对地克珠利中度耐药，29株高度耐药；湖北省35株分离虫株中，有1株中度耐药，34株高度耐药。

表1 河南省鸡球虫分离株对地克珠利耐药性判别结果

表2 湖北省鸡球虫分离株对地克珠利耐药性判别结果

3 讨论

耐药性在鸡球虫中广泛存在，这目前是制约养禽业快速发展的最大难题之一。在几种常见的抗鸡球虫药中，地克珠利近些年来的普及使得对其耐药现象日益严重，因此对于地克珠利耐药机制的研究逐渐提上了日程。有研究显示，地克珠利可以在很低的药物浓度下，使鸡球虫体内质网扩张并空泡化[7]，而且对宿主本身不产生任何影响，除此之外还可抑制球虫磷酸合成中心PSⅡ的重要组成成分D1蛋白质的功能。而D1蛋白质与低氧状态的电子传递有关系，有可能提供虫体氧自由基，使其更容易侵入宿主细胞[8]。但是目前监测一个地区抗球虫药的耐药性仍旧依赖传统的鸡体笼养试验，鸡体笼养试验目前能够最大程度的反映出该地区试验用药的耐药现状。本研究中，发现河南省和湖北省两省鸡球虫分离株对地克珠利耐药现象十分普遍，仅有1株虫株为轻度耐药，共计5株虫株中等程度耐药，其余虫株全部高度耐药，这反映出两省地克珠利的防控鸡球虫压力较大。该研究结果对于该地区鸡球虫病的防治提出了更高的要求，需要针对该地鸡球虫的情况制定相应的防治方法，穿梭用药和联合用药是最易实施的方法，另外适当的轮换用药对防治也有帮助，但不论是穿梭用药、联合用药或是轮换用药都应当尝试一些新药或者本地区不常用的抗球虫药。有一些新型鸡球虫药的问世比如新型三嗪类药物[9]往往在一段时间内能实现对鸡球虫的有效防控，另外混合传统中草药[10]的相关研究对于鸡球虫防控方式提出了新的思路，但不论是中药还是新型药物长时间施用后难免产生耐药现象。当然，除了用药，传统的疫苗防控法确为有效，随着对鸡球虫的抗原方面的进一步研究，顶膜抗原(apical membrane antigen，AMA)-1[11]和免疫定位蛋白(immunolocalization protein，IMP)-1已引入重组疫苗作为对抗鸡球虫病的替代控制措施。目前正在探索通过稳定或瞬时转染构建的转基因艾美耳球虫作为艾美耳球虫疫苗抗原的新型递送载体，该方法使得多种疫苗抗原同时刺激机体进而提高了保护功效，以转基因艾美耳球虫作为载体的方法可以填补作为抗球虫疫苗，用于鸡球虫病控制的空白[12]。此外，能够将疫苗接种法和联合穿梭用药并行的方法对鸡球虫病进行防控也是近些年来的防控新策略，不过该方法对于养鸡场的用药监控和成本条件的要求较高，未来还有很大的发展潜力。