不同多酚处理对荔枝果肉抗氧化能力的影响

杨梓萌，白新宇，尹 楠，曾教科

(海南大学园艺学院，海口，570228)

荔枝LitchichinensisSonn.是无患子科荔枝属常绿果树，果皮鲜红色，果肉富含酚类、多糖、维生素等营养物质，具有抗氧化、护肝、改善脂质代谢以及降血糖等功效[1-2]。荔枝多以鲜食为主，果实收获于高温高湿的季节，采后呼吸作用强，常温条件下2～3 d即发生果皮褐变，品质下降或商品性丧失，极不耐贮运[3-4]。近年来，大量研究报道荔枝保鲜技术措施，如SO2熏蒸[5]、低温[6]、氢水[7]、包装[8]、有机酸[9]等，均可用于维持荔枝采后果实品质，延缓果皮褐变以及延长贮运寿命[4，10]。其中，SO2熏蒸处理是目前荔枝应用最广的一种采后保鲜方式，但会在果实可食部位残留而影响消费者健康[5]。因此，可替代SO2的天然抗氧化剂或保鲜剂被进一步研发。

多酚是植物次生代谢产物，源于莽草酸衍生的苯丙素和聚酮途径。多酚作为一种天然的抗氧化剂，在植物抗性、植物营养和产品添加剂等方面发挥重要作用[11]。近年来，多酚在果蔬保鲜上的研究也受到广泛关注[12]。研究报道，茶多酚可有效延缓荔枝、油梨等果实品质劣变，延长保鲜期[13-14]。苹果多酚处理可以维持荔枝、芋艿等采后较好的风味和营养品质[15-16]。绿原酸处理可延缓油桃果皮色泽转变，增强抗氧化活性，维持采后品质[17]。其他多酚类物质如p-香豆酸[18]、原花青素[19]、荔枝多酚[20]等，也可延缓果实采后衰老，延长货架期。

虽然茶多酚和苹果多酚可维持荔枝采后品质，但因其成本较高而并未应用于生产。我们前期研究结果发现，原花青素(PA)、p-香豆酸(p-CA)、绿原酸(CHA)、茶多酚(TPP)和苹果多酚(APP)等酚类物质可有效延缓采后荔枝果皮褐变和衰老进程，且原花青素处理表现最显著的抗氧化能力[21]。因此，在前期研究基础上，我们进一步系统评价这5种多酚处理对采后荔枝果肉总酚、总黄酮和维生素C含量及抗氧化活性的影响，为多酚应用于荔枝果实采后保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“妃子笑”荔枝LitchichinensisSonn.cv.Feizixiao果实采摘于海口市永兴镇荔枝果园，挑选大小均匀、成熟度一致、无机械损伤和病虫害的果实，带枝采摘于当天运回实验室备用。

原花青素(≥98%)、苹果多酚、97%茶多酚、98%绿原酸、98%p-香豆酸均购于西安泽朗生物科技有限公司，97%奎诺二甲基丙烯酸、2，2-联苯基-1-苦基肼基(≥98.5%)、99% 2，4，6-三吡啶基三嗪、98% 2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐、福林酚购于麦克林生化科技有限公司，三氯化铁、甲醇、无水乙醇购于西陇科学股份有限公司，无水乙酸钠、碳酸钠购于广州化学试剂厂，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产；电子天平，上海浦春计量仪器有限公司产；智能数显恒温水油浴锅，郑州予华仪器制造有限公司产；高速冷冻离心机，江苏省盐城市凯特实验仪器有限公司产；超声仪，浙江省宁波市新芝生物科技股份有限公司产。

1.3 方法

1.3.1 荔枝保鲜处理 带枝荔枝剪留果柄长0.5 cm果实后，随机分成6组，分别用清水(对照)、3 g/L原花青素、0.6 mmol/Lp-香豆酸、1 g/L茶多酚、5 g/L苹果多酚和50 mg/L绿原酸溶液浸泡10 min，果实自然晾干后分别装入PE保鲜袋中，放置于(20±1)℃、相对湿度85%～90%的培养箱中贮藏10 d；每2 d取样1次测定相关指标，每处理重复3次，每重复果实15个。

1.3.2 总酚含量测定 参考徐灼辉等[22]的方法并稍作改进，称取果肉1 g用无水甲醇研磨后，4 ℃下避光提取2 h后，12 000 rpm离心20 min即得提取液；取提取液上清液0.1 mL加入福林酚试剂0.2 mL和10%碳酸钠溶液2.7 mL，在50 ℃恒温水浴锅中保温30 min，取混合液3 mL，以蒸馏水为对照，置于700 nm处测吸光值，并带入回归方程计算总酚含量，单位为mg/g，每个样品重复测定3次。

1.3.3 总黄酮含量测定 参考朱杨帆等[23]的方法并稍作改进，将1.3.2中制作的提取液以无水甲醇为对照，在325 nm波长下测定其吸光值，并带入回归方程计算总黄酮含量，单位为mg/g，每个样品重复测定3次。

1.3.4 维生素C含量测定 参考曹建康等[24]的方法进行，称取果肉样品2 g加入草酸溶液研磨后，12 000 rpm离心20 min，收集上层溶液加入三角瓶中，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至出现微红色，且30 s内不褪色为止，并记录用量，计算维生素C含量，单位为 mg/100 g。维生素C含量=V×(V1-V0)×ρ/(VS×m)×100，式中，V为样品提取液总体积，mL；V1为样品滴定消耗的染料体积，mL；V0为空白滴定消耗的染料体积，mL；ρ为1 mL染料溶液相当于维生素C的质量，mg/mL；VS为滴定时所取样品溶液体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.5 DPPH自由基清除能力测定 参考孙海龙等[25]的方法并稍作改进，取1.3.2中制作的提取液加入DPPH溶液中，避光反应，以无水甲醇加DPPH试剂为参比溶液，在517 nm下测定吸光度值以清除率计算自由基清除能力。DPPH自由基清除能力(%)=[1-(AS-A0)/AC]×100，式中，AS为样品实测吸光值，A0样液加无水甲醇的吸光值，AC为DPPH溶液加无水甲醇的吸光值。每个样品重复测定3次。

1.3.6 FRAP抗氧化能力测定 参考徐灼辉等[22]的方法并稍作改进，称取样品进行研磨，取研磨缓冲液超声5 min后，5 000 rpm离心5 min，取上清液并加入70%乙醇3 mL，进行第2次超声离心，离心后合并两次上清液并冷藏保存获得提取液。取提取液加入FRAP工作液，混匀反应20 min，以蒸馏水代替样品加入FRAP工作液作为空白调零，在593 nm处读取吸光值，以Trolox(水溶性维生素E)浓度0.1～1.6 mmol/L代替样品做标准曲线。FRAP抗氧化值以Trolox当量计，单位为mmol/g。每个样品重复测定3次。

1.3.7 ABTS抗氧化能力测定 参考徐灼辉等[22]的方法并稍作改进，向试管中加入ABTS工作液，加入1.3.6提取液100 μL，用无水甲醇作空白对照，用紫外可见分光光度计测定其在734 nm的吸光值，以清除率计算抗氧化能力。ABTS抗氧化能力(%)=(A0-A)/A0×100，式中，A0为稀释后工作液吸光度值，A为样品吸光度值。每个样品重复测定3次。

1.4 数据处理

使用SPSS 22.0统计软件进行Duncan多重比较、相关性分析和主成分分析，用Microsoft Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 对果肉总酚含量的影响

由图1可知，在贮藏期间，所有处理总酚含量整体呈先上升后下降的趋势。对照(清水)总酚含量在贮藏2 d达到峰值；不同多酚处理的果实总酚含量在贮藏2～8 d达到峰值，并且贮藏中后期其值显著高于对照(清水)(p<0.05)，说明多酚处理能够增强荔枝果实贮藏中后期总酚含量。其中，原花青素处理的荔枝果肉总酚含量增加最显著。

注：相同时间不同小写字母表示差异显著，p<0.05。图2至图6同。

2.2 对果肉总黄酮含量的影响

由图2可知，总黄酮含量在贮藏过程中略有下降，但变化趋势不明显。与对照(清水)相比，除了贮藏8 d，其余时间茶多酚、苹果多酚和绿原酸处理与对照(清水)之间均无显著性差异。原花青素和p-香豆酸处理在一定程度上维持较高的总黄酮含量，其中原花青素处理的效果最显著(p<0.05)。

图2 原花青素等多酚处理对“妃子笑”荔枝果肉总黄酮含量的影响

2.3 对果肉维生素C含量的影响

由图3可知，随着贮藏时间的延长，荔枝果肉中维生素C含量呈下降趋势。与对照(清水)相比，多酚处理可以延缓维生素C含量下降。其中，原花青素和绿原酸处理对维生素C含量的保持效果较显著，且与对照(清水)维生素C含量有显著性差异(p<0.05)；而p-香豆酸处理与对照(清水)的维生素C含量基本无显著性差异。因此，原花青素和绿原酸处理可显著维持荔枝果肉维生素C含量。

图3 原花青素等多酚处理对“妃子笑”荔枝果肉维生素C含量的影响

2.4 对果肉抗氧化活性的影响

由图4至图6可知，3种方法测定的对照(清水)果肉抗氧化活性在贮藏过程中均呈下降趋势。与对照(清水)相比，不同多酚处理显著(p<0.05)抑制DPPH自由基清除能力的下降。其中，在贮藏前期(0～4 d)，原花青素、p-香豆酸和绿原酸对抗氧化活性的保持效果更显著；在贮藏中后期(6～10 d)，原花青素、茶多酚、苹果多酚处理对抗氧化活性的保持效果更显著。说明多酚处理可以保持荔枝果肉较高的抗氧化活性，其中以原花青素处理的保持效果最显著(p<0.05)。

图4 原花青素等多酚处理对“妃子笑”荔枝果肉DPPH自由基清除能力的影响

图5 原花青素等多酚处理对“妃子笑”荔枝果肉FRAP抗氧化能力的影响

图6 原花青素等多酚处理对“妃子笑”荔枝果肉ABTS抗氧化能力的影响

采后对照(清水)果肉FRAP抗氧化能力逐渐下降。多酚处理显著(p<0.05)抑制FRAP的下降。在贮藏前中期(0～6 d)，所有多酚处理均对抗氧化活性有一定的维持效果；在贮藏中后期(8～10 d)，以原花青素和绿原酸处理的效果更显著(p<0.05)。说明多酚处理可以保持荔枝果肉较高的FRAP活性，以原花青素和绿原酸处理的保持效果较显著(p<0.05)。

采后对照(清水)果肉ABTS抗氧化能力呈逐渐下降趋势，多酚处理显著(p<0.05)抑制ABTS的下降。在贮藏前期(0～4 d)，原花青素、p-香豆酸、茶多酚和苹果多酚处理均对抗氧化活性有一定的维持效果；在贮藏后期(8～10 d)，以绿原酸处理的效果更显著(p<0.05)。说明多酚处理可以保持荔枝果肉较高的ABTS活性，且不同多酚发挥作用的时期不相同。

2.5 相关性分析

对荔枝果肉中总酚、总黄酮、维生素C含量与DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力、ABTS抗氧化能力进行相关性分析。由图7可知，总黄酮含量与 DPPH自由基清除能力显著(p<0.05)正相关，相关系数为0.648；维生素C含量则与FRAP及ABTS抗氧化能力均呈显著(p<0.05)正相关，且相关系数分别为 0.626和0.564。抗氧化指标之间也存在相关性，FRAP抗氧化活性与ABTS抗氧化活性之间显著(p<0.05)正相关关系，相关系数为0.793。

注：*表示显著相关，p<0.05。

2.6 果肉抗氧主成分分析

对不同处理的荔枝果肉抗氧化物质和活性进行主成分分析，由表1可知，成分1和成分2的特征值大于1，且两者的累积贡献率达到71.858%。因此，可以抽取成分1和成分2代表所有变量，利用成分1和成分2作载荷图。

表1 “妃子笑”荔枝果肉抗氧主成分分析

由图8可知，PC1、PC2分别解释了变量的40.24%、31.62%。总酚含量、总黄酮含量、DPPH自由基清除能力均分布在PC1和PC2的正方向；ABTS抗氧化能力、FRAP抗氧化能力和维生素C含量分布在PC1的正方向、PC2的负方向。因此，不同处理可以通过PC2较好的区分，主要通过总黄酮含量和维生素C含量体现。

图8 “妃子笑”荔枝果肉抗氧主成分分析载荷

2.7 不同处理的果肉抗氧化活性综合评价

选取前两个主成分PC1和PC2(累积贡献率为71.86%)，对不同处理及不同贮藏时间的荔枝果肉进行抗氧化活性综合评价，将标准化后的原始数据代入主成分表达式计算各个样本的主成分得分，样本得分为Y1和Y2，F=0.402 43Y1+0.316 15Y2，据此函数得出荔枝果肉抗氧化能力综合得分。由表2可知，绿原酸处理贮藏8 d的综合抗氧化活性得分最高，其次原花青素处理贮藏6 d的组别、对照贮藏0 d、原花青素处理贮藏4 d的综合抗氧化活性得分较高。说明原花青素、绿原酸处理的荔枝果肉抗氧化活性较高。

表2 不同多酚处理的不同贮藏时间“妃子笑”荔枝果肉抗氧化活性得分和综合评价得分

比较不同处理累积得分发现，原花青素处理的荔枝果肉抗氧化活性得分最高，对照(清水)的得分最低。不同处理的得分从高到低依次为：原花青素、绿原酸、苹果多酚、茶多酚、p-香豆酸和对照(清水)。

3 结论与讨论

果蔬中具抗氧化活性的营养物质如酚类、黄酮类、维生素C等，其抗氧化活性来自氧化还原作用；而多酚是植物天然的抗氧化剂，兼具果蔬保鲜和人体保健功效[26]。本试验中，随着贮藏时间延长，荔枝果肉中总酚含量逐渐上升而后下降，呈峰形变化，而多酚处理可增强贮藏中后期果肉总酚的积累。这与采后荔枝果肉总酚含量呈峰形变化[27]，苹果多酚可延缓采后荔枝果肉总酚含量的下降等结论相一致[28]。荔枝果肉总黄酮和维生素C含量采后呈下降趋势[29]，多酚处理可以维持较高的总黄酮和维生素C含量。说明多酚处理可以增强荔枝果肉抗氧化物质的含量，以维持果肉较高的抗氧化能力和营养品质。采用3种不同的抗氧化评价方法，发现黄酮含量与DPPH自由基清除能力显著正相关，维生素C含量与FRAP和ABTS抗氧化能力显著正相关(p<0.05)，说明黄酮和维生素C含量对荔枝果肉总抗氧化能力的贡献较大。

此外，本研究发现，原花青素处理具有比其他多酚处理更显著的抗氧化能力维持效果(排名第一)。原花青素是植物体内的天然多酚物质，具有抗氧化和清除自由基作用，能够有效的清除活性氧进而保护细胞[30]。相关研究表明，原花青素处理可以通过增强香蕉抗氧化酶活性和非酶促抗氧化物质含量，来维持细胞氧化还原态的稳定；同时促进内源原花青素的合成，从而显著延缓香蕉采后衰老进程[19]。本试验中，原花青素处理也发挥了类似的作用，通过显著增强果肉总酚、总黄酮和维生素C等抗氧化物质含量，维持较高的抗氧化能力，从而维持荔枝果肉较高的营养品质。本试验筛选的原花青素具有价格低、易获得等特点，适用于生产实践。