温度胁迫对“热农1号”杧果花粉萌发的影响

刘馨语，杜成勋，资 晶，肖艺琳，严 晶，李春宏，陈东东，王松标，梁清志

(1 四川省攀枝花市仁和区气象局，四川攀枝花，617000；2 四川省农业气象中心/南方丘区节水农业研究四川省重点实验室，成都，610072；3 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江，524091)

杧果MangiferaindicaL.属于漆树科杧果属植物，是重要的热带果树之一[1]。据FAO统计，2015年世界杧果产量超过了4 500万t，是世界上继香蕉、葡萄、柑桔和苹果之后的第5大水果，被誉为“热带果王”[2]。中国作为世界第二大杧果生产国，在四川、云南、广西、海南等热区广泛栽培[3]。目前，金沙江干热河谷流域晚熟杧果种植面积已超过6.67万hm2，杧果种植区主要集中在海拔937～1 500 m之间，气候干热，光照充足，昼夜温差大，独特的环境气候和产业技术体系的创新共同造就了该地区优异的果品品质。然而，由于缺乏对该区域杧果晚熟及品质形成机制的研究，尚未能很好地解释该区域杧果“晚熟”和“品质一流”的成因，不能更有效地突出地区品牌和价格优势，影响了金沙江干热河谷流域晚熟杧果产业整体效益的充分发挥。

杧果多为异花授粉亦能自花结实，少数品种表现自交不亲和[4]。其花粉数量是影响着果率和产量的因素之一[5]。杧果的花柱和柱头都较小，萌发花粉数量较少，通常只有1～3个花粉管萌发进入花柱，并且只有1个花粉管能生长到达子房内部完成受精[6]。许多研究表明[7-8]，开花期对温度的要求最为严格，温度胁迫常常会引起花粉败育及花粉与柱头发育不同步等现象[9]。将花粉作为表征植物物种或基因型耐受性的有利标记可知[10]，低温和高温胁迫大多对花粉的表现有不利影响[11]。低温和高温胁迫以不同速率降低了不同杏仁基因型的花粉萌发率和花粉管长度[12]。同样，高温胁迫导致不同基因型花生和椰子花粉萌发和花粉管生长以不同速度下降[13]。低温诱导不同基因型杏仁和甜樱桃花粉萌发和花粉管伸长的反应也不同[14]。由此可以看出，不同基因型对温度胁迫的花粉萌发率和花粉管生长差异性可以用来评估物种或基因型的耐受性[15]。为此，累积应激反应指数(Cumulative Stress Response Index)通常用来表示不同基因型在应激条件下的相对敏感性[16-17]。因此，温度胁迫对花粉萌发、花粉管长度的影响可作为评价不同基因型花粉抗性和耐受性的指标。近年来，由于全球气候变化，导致极端天气越来越频繁，杧果花期倒春寒和干热风已经成为制约金沙江干热河谷晚熟杧果产业发展的重要问题，严重影响植物花期花粉的萌发及着果。由于这些影响都将直接造成严重的经济损失，因此温度对花粉萌发阶段的影响研究越来越受到重视。此外，为了确保农业的可持续性，识别、分辨花粉对极端天气的响应和耐受度变得越来越重要。为此，关注温度对花粉的响应是非常重要的。

本研究以西南山地杧果主栽品种“热农1号”为供试品种，通过离体萌发的方法，对其进行不同程度的温度胁迫，结合累积应激反应指数(CSRI)，明确“热农1号”杧果花期最适温度以及花粉活力高温及低温临界值，以期为更好地阐明花粉响应高低温胁迫的分子机理、及制订相应的抵御温度胁迫生产技术措施等提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

“热农1号”杧果花粉于2021年3月取自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所杧果种质资源圃，在盛花期(开花数占总花量的15%～75%)随机选取当天开放的新鲜花药放入培养液中，充分震荡后迅速带回实验室用于温度胁迫的观察及研究分析。

1.2 方法

配置杧果花粉培养液：将蔗糖150 g、硼酸150 mg、硫酸钙6.0 mg、硫酸镁100 mg、硝酸钾100 mg、聚乙二醇250 g混合，定溶至1 L。将培养液加热煮沸待其充分溶解，冷却后装瓶常温保存备用。

采集花粉与预处理：将配置好的培养液分装在500 μL离心管中，每个离心管里随机取花药12～15粒，充分震荡使花药上的花粉附着于培养液中。

不同温度条件下花粉离体培养：将离心管分别存放于14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 ℃的培养箱中分别进行1、3、5 h培养。

不同温度条件下花粉萌发率的测定：取干净凹面载玻片，向凹穴滴入1～2滴混合均匀的培养液进行观察，每处理重复3次，每重复随机选取5个视野，共观察花粉粒200～500粒。以花粉管长度超过花粉粒直径为花粉萌发标准，分别观察1、3、5 h持续培养下不同温度处理的萌发花粉数、花粉总数并统计萌发率。花粉萌发率(%)=萌发花粉数/花粉总数×100。

花粉管长度测定：制备3张载玻片，使用光学显微镜(Olympus BX-51)测量每张载玻片大约50个萌发花粉粒的长度，取平均值。

1.3 累积应激反应指数(CSRI)测定

以对照(c)组和处理(t)组的花粉萌发率(GR)和花粉管长度(TL)为指标，测定花粉管对温度胁迫的响应，计算CSRI[16]。CSRI=(GRt-GRc)/GRc+(TLt-TLc)/TLc×100。

1.4 数据分析

采用Excel和SPSS 18.0统计分析数据，采用单因素方差分析(ANOVA)，p值小于0.05。

2 结果与分析

花粉不同萌发状态见图1。从图2可以看出，花粉萌发率随温度的变化呈类似正态分布。22 ℃，“热农1号”的花粉平均萌发率为9.3%；随后随温度上升，花粉萌发率呈明显增加的趋势；28 ℃时达最大值，为37.2%；当花粉萌发温度在最适温度(28 ℃)以上时，花粉萌发率又随温度升高迅速下降。说明低温和高温均对杧果花粉离体萌发具有明显的抑制作用。当温度低于20 ℃，“热农1号”花粉不萌发；高于32 ℃，温度开始抑制花粉萌发，不仅影响花粉粒萌发，而且抑制花粉管伸长；34 ℃时，花粉萌发率全部降至2.0%以下。在22～32 ℃温度范围内，花粉管生长良好，平均长度可达花粉直径的3～4倍，说明“热农1号”花粉萌发温度为22～32 ℃，其中最适温度为28 ℃，高于32 ℃或低于22 ℃都会抑制花粉萌发，最终可能影响“热农1号”授粉和着果。杧果花粉一般培养1 h开始萌发，培养5 h后已基本萌发，随后萌发率及花粉管长度随培养时间的延长不再有明显变化[6]。由于培养时间超过20 h，培养基受污染开始大量生长菌丝，不利于萌发率的统计[13]。因此，本研究分别对花粉进行持续1、3、5 h培养观察。

图1 “热农1号”杧果离体花粉不同萌发状态

图2 不同温度与时间处理对“热农1号”杧果离体花粉萌发和花粉管长度的影响

随着温度胁迫时间的持续增加，当温度低于20 ℃，花粉均无萌发，且不同时间处理的花粉萌发率无明显差异；当温度介于22～32 ℃之间，花粉萌发率受处理时间的影响差异明显，随处理时间的增加，花粉萌发率显著降低；当温度高于34 ℃，花粉无萌发，且花粉管形态异常。其中，处理时间越长，高温的影响更明显。

32 ℃持续处理5 h后，花粉萌发率降低至10%以下；而34 ℃持续处理1 h和3 h，花粉萌发率降至2.0%以下。对于低温而言，22 ℃持续处理5 h后，花粉萌发率降至5.1%；1 h处理的花粉萌发率为13.1%。说明随着处理时间延长，花粉萌发适宜温度范围缩小，即长时间的极端温度胁迫会抑制花粉萌发。

试验发现，不同时间处理的花粉萌发率均以28 ℃时最高，其中1 h处理的花粉萌发率最高，为37.2%。低温或高温胁迫下，花粉萌发率下降，即极端低温(22 ℃)处理1、3、5 h后花粉萌发率分别下降64.7%、73.2%、86.0%；极端高温(32 ℃)处理1、3、5 h后花粉萌发率分别下降51.8%、60.6%、74.2%。由此可知，花粉萌发受到极端低温或高温胁迫失活后，在胁迫时间上无显著性差异。不同温度相同处理时间的花粉管长度以28℃时最长，相同温度不同处理时间以5 h处理的花粉管长度最长。然而，极端低温或高温胁迫下花粉管的生长却出现了退化。低温(22 ℃)胁迫下1 h的花粉管长度减少了55.0%，3 h减少了43.5%，5 h减少了40.0%。高温(32 ℃)胁迫1、3、5 h下花粉管长度分别减少约27.5%，32.6%，30.0%。说明与高温胁迫相比，低温胁迫对花粉管生长的抑制作用更大。试验中，22 ℃处理1、3、5 h的CSRI分别为-102.94、-93.24、-90.95，32 ℃处理1、3、5 h的CSRI分别为-71.10、-56.84、-69.52。低温(22 ℃)胁迫下CSRI均小于高温(32 ℃)胁迫，说明“热农1号”对低温更敏感。

3 结论与讨论

试验结果表明，杧果花粉萌发对低温或高温胁迫及胁迫时间都具有敏感性。在不同温度和时间处理下，杧果花粉萌发率和花粉管长度均有变化。对龙眼[18]、扁桃[12]和椰子[19]等作物的研究发现，低温对作物花粉萌发和花粉管生长有抑制作用；对菜豆[20]、大豆[21]、水蜜桃[22]等作物的高温胁迫研究表明，高温对其生长发育抑制作用也很明显，本研究结果类似。关于温度变化对花粉萌发的不利影响，一些研究人员将不同物种甚至不同基因型的响应程度联系起来[23]，在温度胁迫下对花粉进行性能测试[24]。

我国杧果主要在南方热区广泛栽培，生产中，杧果花期常遭遇低温阴雨天气导致花粉母细胞减数分裂异常，进而授粉受精不良而出现落果[24]。对“热农1号”不同温度条件下花粉萌发率和花粉管长的累积应激反应指数(CSRI)分析发现，低温对花粉管的生长有明显抑制作用，与前人研究一致。对“热农1号”不同温度胁迫下花粉萌发率变化分析发现，高温比低温对杧果花粉萌发造成的破坏性影响更大[25]。

范眸天等[5]研究发现，杧果花粉20 ℃以下无萌发，与本试验结果一致。本研究结果表明，22 ℃以下和32 ℃以上温度，花粉活力随温度胁迫时间延长变化较缓慢；而24～30 ℃时花粉活力随时间变化比较迅速；20 ℃以下和34 ℃以上温度花粉无萌发，随胁迫时间延长，花粉萌发率无明显变化。说明“热农1号”杧果花粉萌发温度介于22～32 ℃之间，其中花粉萌发最适温度范围为24～30 ℃。

采用离体萌发法，于盛花期对“热农1号”杧果花粉进行不同温度和持续时间的处理发现，温度和持续时间均对花粉活力有明显影响，花粉萌发率随温度变化呈类似正态分布；24～30 ℃温度范围内花粉活力较好，当温度高于32 ℃或高温处理时间5 h对花粉活力伤害均较大，低于20 ℃或高于34 ℃花粉不萌发。结合累积应激反应指数(CSRI)分析发现，低温对花粉管长度影响更明显，高温对花粉萌发影响更大。总的来说，“热农1号”杧果生殖期对低温胁迫更敏感。