3种柑桔材料水杨酸处理前后对柑桔溃疡病的抗性分析

戴文珊，廖 颖，韩雨菲，刘润东，刘媛媛，王 敏

(赣南师范大学脐橙学院/国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州，341000)

柑桔是世界第一大果树，其面积和产量均居第一，目前在146个国家和地区有栽植，产地主要集中在中国、美国、巴西及地中海沿岸国家[1]。根据FAO的统计数据分析，2017年世界柑桔种植面积达927万hm2，产量达1.58亿t，是仅次于小麦、玉米的第三大国际贸易农产品[2]。柑桔也是我国南方地区最重要的果树，据统计，2019年我国柑桔面积和产量分别为261.70万hm2和4 584.54万t[3]，柑桔产业在扩大柑桔主产区城乡居民就业、促进农业经济增收等方面作出了巨大贡献[4]。

柑桔溃疡病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是由柑桔黄单胞杆菌柑桔亚种Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)引起的病害，对柑桔产业威胁极大[5]。作为一种细菌性病害，其致病菌主要通过柑桔伤口或者气孔、皮孔等孔道进入植物体内，仅需约20 min即可完成感染过程，可为害叶片、枝条、果实等器官组织[6-10]。柑桔感染溃疡病后，最初在柑桔叶背出现点状黄色或暗黄色的斑点，病斑逐渐扩大，同时叶片病斑两面均逐渐隆起、表皮开裂、木栓化、周围伴有黄色晕圈，随着感病时间的延长，症状逐渐加重，感病后期病斑中央成火山口状开裂，表现出黄褐色的圆形、木栓化病灶[11-12]。柑桔感染溃疡病后，轻则引起果实外观和品质变差、产量下降等，重则造成柑桔树落叶、落果、枝梢枯死、幼树死亡等严重后果[13-14]。前人研究发现，不同柑桔对柑桔溃疡病的敏感性有很大差异，金柑对溃疡病的抗性最强[15-16]，甜橙高感溃疡病[17]。枳作为常见的柑桔砧木，也会受到柑桔溃疡病感染。最新研究表明，嫁接柑桔时以枳为砧木较其他砧木对柑桔溃疡病的敏感度更高[18]。然而，枳、甜橙及金柑对柑桔溃疡病的综合抗性尚不清晰。

植物激素信号分子在面对病原物侵染时，能够形成一个复杂的防御体系，使植物做出最为有效的防御反应[19-23]。水杨酸(salicylic acid，SA)是调节植物抗病信号途径的重要内源信号分子，其通过激活植物体内防御基因的表达，从而使植物表现出对生物胁迫的抗性反应[24-28]。大量研究表明，SA可以诱导植物对病原菌的抗性反应，主要是通过诱导植物细胞膜脂过氧化，产生超敏(hypersensitive response，HR)反应，并诱导植物PR(pathogenesis-related)基因的表达，进一步诱导植物的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[29-33]。因此，采用SA处理植物并分析处理前后植物的抗病性差异与生理变化，从而解析植物对病菌的抵抗机制，是非常有效的办法。

笔者对柑桔亚科3个属(枳属、柑桔属、金柑属)中各自代表种(枳、甜橙和金弹)进行外源SA处理，观察分析3种材料接种柑桔溃疡病菌后叶片表型变化、发病症状、细菌生长趋势，并测定植株相应生理数据指标，鉴定3种材料在水杨酸处理前后对柑桔溃疡病抗性的差异。同时，分析3种材料经SA处理后抗病相关基因表达的变化，以期初步探索这3种材料对柑桔溃疡病敏感度差异的来源。本试验的研究结果可为柑桔溃疡病抗性育种的亲本选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

转化GFP蛋白的柑桔溃疡病菌Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)由本实验室构建并保存，添加50%甘油冻存于-80 ℃冰箱备用。

NA培养基配方：牛肉膏3 g，氯化钠5 g，蛋白胨10 g，定容至1 L。若配制NA固体培养基则继续加入琼脂粉 20 g后定容至1 L。

3种柑桔材料分别为金弹Fortunellacrassifolia、哈姆林甜橙Citrussinensis‘Hamlin’和枳Poncirustrifoliata，均由赣南师范大学苗圃中心提供。

1.2 方法

1.2.1 柑桔实生苗培养与水杨酸处理 实生苗培养：金弹、甜橙和枳实生苗采用野生型种子，1 mol/L NaOH溶液浸泡15 min去除表面残余果胶，再用2% NaClO溶液灭菌20 min，最后用蒸馏水冲洗3～5遍。在30 ℃培养箱中催芽，保证环境湿润，待发芽后移栽于10 cm× 10 cm培养盆中土培，基质使用品氏营养土(Pindstrup，丹麦)，与蛭石按照3∶1比例混合后种植，每盆种植1株植物。25 ℃人工气候培养箱(光照16 h/黑暗8 h)培养10周后用于溃疡病接种试验。

SA处理：采用200 μmol/L SA进行处理，每盆材料用50 mL SA溶液喷洒叶片+50 mL SA溶液浇灌盆土，对照采用等量蒸馏水进行同样处理。分时间点(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)取样各材料叶片，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱以备RNA提取及定量PCR检测，每组至少取3片叶片。24 h后，分别对SA处理组和对照组进行柑桔溃疡病菌接种。

1.2.2 接种柑桔溃疡病菌 菌株活化：接种前从-80 ℃冰箱中取出保存的Xcc菌株，NA固体培养基划线活化，28 ℃培养箱培养2 d后挑取单克隆菌落，继续在新NA培养基划线扩大培养，2 d后刮取生长的Xcc菌体，无菌水稀释调节，配制为5×107CFU/mL的菌悬液。

接种试验：分别选取金弹、甜橙和枳对照组及SA处理组的盆栽苗各4盆，每盆挑选3片叶，在叶背面采用小号注射器(规格：1 mL)注射Xcc菌悬液，每片叶注射两个接种点，每个接种点接种50 μL。此外，各材料再分别挑选4盆未进行SA处理实生苗，叶片背面注射接种蒸馏水，作为阴性对照。接种完成后将实生苗放回光照培养箱中，28 ℃光照培养，观察材料发病表型并拍照记录。

1.2.3 RNA提取与实时荧光定量PCR分析 对材料方法1.2.1中分时间点取样的各组材料叶片进行RNA提取，植物RNA提取参照RNAiso Plus RNA(TaKaRa，日本)试剂盒的方法进行，cDNA合成利用反转录试剂盒K1622 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，美国)完成。采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR，简称qPCR)方法分析各柑桔材料抗病相关基因的表达，方法参照QuantiNovaTM SYBR○R Green PCR试剂盒(QIGEN，德国)说明书。qPCR的反应体系(10 μL)包括2 × QuantiNova SYBR Green PCR Mix 5.0 μL，Rox染料 0.3 μL，正向引物(10 μmol/L)0.3 μL，反向引物(10 μmol/L)0.3 μL，cDNA模板1.0 μL和ddH2O 3.1 μL。qPCR反应在Applied Biosystems QuanStudioTM 7 Flex Real-Time PCR系统(ABI，美国)内完成。反应程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45个循环。以柑桔Actin作为内参基因，引物序列为Actin F：CATCCCTCAGCACCTTCC；Actin R：CCAACCTTAGCACTTCTCC。以合成的cDNA为模板，每个样品重复4次。以2-ΔΔCT 法进行定量数据分析。

1.2.4 台盼蓝染色 台盼蓝(Trypan blue)是一种细胞活性染料，可以让死亡细胞染色而变蓝，因此常用来作为鉴定细胞生死状态的指示剂。Trypan Blue母液配方：0.02 g Trypan Blue试剂(Sigma，美国)，10 g苯酚，10 mL乳酸，10 mL甘油，10 mL无菌水。Trypan Blue应用液配制方法：按照母液∶96%乙醇=1∶2的体积比例配制应用液。

在注射Xcc菌悬液9 d后分别对金弹、甜橙和枳各组植物材料进行取样，只取注射叶片，每组进行3次生物学重复。将需要进行染色的植物材料放入离心管中，加入Trypan Blue应用液至完全浸泡，沸水煮4 min后，取出自然冷却1 d，再加入脱色液(饱和水合氯醛溶液)进行脱色，中途可更换脱色液，待脱色完全后取出植物材料，平铺于玻璃板上，拍照保存。

1.2.5 相对电导率测定 电导率是衡量细胞膜透性的重要指标，其值越大，说明电解质的渗透量越多，表示细胞膜受损程度越重。在注射Xcc菌悬液9 d后分别对金弹、甜橙和枳各组植物材料进行取样，只取注射叶片鲜样0.1 g，每组进行3次生物学重复。将植物样品用去离子水洗净，放入50 mL离心管中，加入30 mL去离子水，置于旋转摇床上室温下缓慢摇动1～2 h，取出样品，用DSS-307型电导率仪(SPSIC，中国)测量此时电导率C1。之后沸水煮样品10 min，使细胞内离子渗透达到最大，取出样品，室温冷却后测量电导率C2。两次测量均以空白去离子水为对照组，电导率记为C01和C02。相对电导率=[(C1-C01)/(C2-C02)]×100%。

1.2.6 叶绿素含量测定 参照Liu等[34]的方法，略有改动。具体方法如下：在注射Xcc菌悬液9 d后分别对金弹、甜橙和枳各组植物材料进行取样，每组进行3次生物学重复。只取注射叶片叶肉鲜样0.1 g，加入1.9 mL蒸馏水中，冰上研磨成匀浆。取200 μL匀浆液加入4.8 mL 80%丙酮，充分涡旋后，4 000转/min离心5 min，取上清液于分光光度计上测定645 nm处吸光值(记为A645)。总叶绿素含量(Ct，mg/L)计算式如下：Ct=A645×1 000÷34.5。

1.2.7 柑桔溃疡病菌的荧光显微镜观察 试验所用的Xcc经改造后融合有GFP蛋白，在荧光显微镜下可观察到细菌GFP荧光。在注射Xcc菌悬液后1、3、5、7和9 d，分别选取各组注射柑桔叶片，用6 mm孔径打孔器在叶片边缘打孔，每组3个重复，将打孔取下的叶圆片加入2 mL离心管中，放入2颗研磨珠和200 μL无菌水，磨样机磨样后3 000 转/min离心30 s，吸取上清液至新的1.5 mL离心管中，取10 μL滴加到血细胞计数板上，荧光显微镜下进行观察、拍照并计算柑桔溃疡病菌数，每组进行3次生物学重复。

1.3 数据分析

使用SAS 8.1软件对数据进行统计分析，依据邓肯氏新复极差法比较显著性差异。

2 结果与分析

2.1 SA处理对发病症状的影响

试验结果看出，未经过SA处理的甜橙与枳均在接种Xcc后的第3天开始出现发病症状，并随着时间的延长逐渐加重；枳的病症较甜橙更严重，接种第9天枳叶片开始出现显著的水渍化病症。经过SA处理后，甜橙和枳接种Xcc后的发病表型均得到缓解，症状更轻。经过SA处理或未经过SA处理的金弹接种Xcc后均无显著病症出现，但未经过SA处理的叶片接种Xcc后有黄化倾向(见图1)。这表明金弹对柑桔溃疡病具有很高的抗性；SA处理确实可以增强3种柑桔材料对柑桔溃疡病的抗性。

注：Cs：甜橙；Ptr：枳；Fc：金弹；Xcc：接种溃疡病菌(未经水杨酸处理)；Xcc+SA：水杨酸处理后接种溃疡病菌。图2和图3同。

2.2 SA处理对感病后病菌增殖的影响

试验结果看出，未经SA处理的甜橙、枳和金弹分别在接种Xcc后第3天、第3天和第5天开始能够观察到细菌GFP荧光，且随着时间的推移，细菌数量逐渐增大，到第9天，甜橙、枳和金弹的Xcc数量分别为3.36×107、4.75×107和1.9×107CFU/mL。经过SA处理的甜橙、枳和金弹均在接种Xcc后第5天开始能够观察到细菌GFP荧光；到第9天，甜橙、枳和金弹的Xcc数量分别为1.39×107、2.05×107和1.18×107CFU/mL，均显著低于对应时间未处理组材料(见图2)。这表明，SA处理能够抑制甜橙、枳和金弹体内Xcc的增殖。

图2 3种柑桔材料经水杨酸处理后接种柑桔溃疡病菌的增殖情况

2.3 SA处理对感病后死亡细胞数量的影响

试验结果看出，甜橙、枳和金弹对照(清水处理并接种清水)叶片均未被染色。未经SA处理的甜橙、枳和金弹，叶片接种Xcc后，接种部位出现不同范围的染色，其中，枳的染色程度最深、范围最广，其次是甜橙，金弹仅在接种临近部位有较浅染色。经过SA处理的甜橙、枳和金弹，叶片接种Xcc后，其染色程度均有明显降低，尤其金弹的叶片几乎无染色症状出现(见图3)。这表明，接种Xcc后，金弹叶片细胞的死亡量较甜橙与枳更少，同时，SA处理可以降低3种柑桔材料细胞的死亡量。

图3 3种柑桔材料经水杨酸处理后接种柑桔溃疡病菌叶片的台盼蓝染色

2.4 SA处理对感病后细胞膜透性和叶绿素含量的影响

试验结果看出，未经SA处理的甜橙、枳和金弹接种Xcc后叶片的相对电导率分别为19.3%、26.6%和13.6%，均显著高于清水处理并接种清水的对照(分别为14.1%、13.7%和11.0%)，与经过SA处理3种柑桔材料接种Xcc后叶片相对电导率(分别为17.5%、25.6%和11.7%)差异不显著(见图4)。这表明，接种溃疡病菌后，金弹叶片细胞膜受损程度最轻，而甜橙和枳叶片受损程度较重；经过SA处理后对感染溃疡病菌后的细胞膜受损的改善不明显。

注：数柱上不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。表5同。

未经SA处理的甜橙、枳和金弹，接种Xcc后叶片叶绿素含量(分别为1.62、4.46和1.03 mg/g)，显著低于清水处理并接种清水的各对照(分别为3.89、5.06和8.00 mg/g)。其中，金弹的降幅最大，这与金弹叶片接种Xcc后出现黄化症状的现象吻合。经过SA处理后的3种材料接种Xcc后叶片中叶绿素含量(分别为2.87、4.84和4.22 mg/g)与经SA未处理相比均有不同程度的升高，光合效率均得到一定程度的改善(见图5)。

图5 3种柑桔材料经水杨酸处理后接种柑桔溃疡病菌叶片的叶绿素含量

2.5 SA处理对抗性相关基因表达的影响

试验结果看出，经SA处理后，抗病基因NPR1、EDS1、ICS1、PAD4和PR1在3种柑桔材料中均有不同程度的上调表达。其中，NPR1、PR1在金弹中被诱导上调表达最明显，SA处理3 h时的相对表达量(NPR1为4.81，PR1为12.59)显著高于甜橙和枳。经SA处理后，PAL1基因在甜橙中的表达量无显著变化，但在金弹和枳中均上调表达(见图6)。

注：星号表示数值与对应0 h的差异显著性，*p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。

3 讨论

SA是植物免疫反应中起重要作用的信号分子，当植物受到活体营养型病原侵染后，体内SA合成急剧增加，进而激活植物对病原产生抗性反应，因此SA是植物体内重要的抗病激素[35]。本研究通过比较柑桔亚科3个属中(金弹属、柑桔属和枳属)代表柑桔种(金弹、甜橙和枳)经过SA处理与否，接种柑桔溃疡病菌后的发病表型与相关生理数据，发现与未经SA处理的柑桔材料相比，经过SA处理的柑桔材料接种柑桔溃疡病菌后，死亡细胞数量减少，相对电导率降低，叶绿素含量提高，柑桔溃疡病菌繁殖量也显著减少。这证明了，SA确实可以诱导金弹、甜橙和枳对柑桔溃疡病菌的抗性。

进一步分析SA处理后3种材料抗病相关基因的表达量，发现NPR1和PR1在金弹中被诱导上调表达且显著高于甜橙和枳。众所周知，SA能诱导包括PR蛋白(pathogenesis-related protein)等多种抗病相关蛋白的产生，从而使植物产生系统获得性抗性。NPR1基因位于SA信号的下游、PR蛋白的上游，是植物SA信号传导过程中的关键调节因子[36]。PAD4(phytoalexin deficient 4)和EDS1(enhanced disease susceptibility 1)形成的复合模型位于SA信号通路的上游，可以促进SA在植物体内的积累，SA积累的反馈回路又可以增强EDS1、PAD4等基因的表达，从而进一步增加植物的抗性功能[37]。PR1是SA诱导激活的PR家族基因中的一员，也是NPR1的下游调控因子，在植物抗病防御过程中扮演了重要的作用[38]。以上3个基因都是参与SA信号通路且在植物抗病响应过程中起正向调节作用的关键基因。经SA处理，NPR1和PR1基因的表达量在金弹叶片中的诱导上调程度显著地高于甜橙与枳，PAD4基因上调表达水平也较高，表明金弹在SA诱导的抗病通路中响应程度较高。进一步推测，金弹对柑桔溃疡病的高抗能力，可能与其受到柑桔溃疡病菌入侵时，体内这3个抗病基因会显著上调相关。