马尾松NAC转录因子基因PmNAC8的克隆及表达分析

镐青青 姚圣 刘佳禾 陈佩珍 张梦洋 季孔庶

（南京林业大学 南方现代林业协同创新中心 林木遗传与生物技术教育部重点实验室，南京 210037）

植物经常遭受自然界中有害的环境胁迫（如干旱、高温、冷害、冻害以及高盐等非生物胁迫），对植物的生长和发育产生不利影响，对农林业生产和生态环境造成严重的损失［1-2］。为了应对不利的环境条件，植物通过调节自身基因的表达来抵御胁迫，从而获得胁迫耐受性［3-4］。AP2/EREBP、WRKY、bZIP、MYB和NAC等类型的转录因子（transcription factors，TFs）已被证明在植物非生物胁迫反应中起着关键作用［5］。NAC转录因子家族是植物特有的一类转录因子，它的命名取自最早发现的矮牵牛（Petunia hybrida Vilm.）NAM 基因、拟南芥（Arabidopsis thaliana）ATAF1基因和CUC2基因的首字母［6］。

在拟南芥中首次报道了NAC转录因子参与干旱反应的调控，据报道，过表达ANAC019、ANAC055和ANAC072可以调控拟南芥干旱应答基因的表达，提高转基因植物的耐旱性［7］。水稻 OsNAP［8］、小麦 TaNAC69［9］和 玉 米 ZmSNAC1［10］等 NAC 转 录因子均参与干旱反应的调控。此外，一些干旱相关的NAC基因也参与植物激素介导的信号通路，如脱落酸、茉莉酸、水杨酸和乙烯的信号通路［11］。Mahmood等［12-13］研究表明ANAC032促进植株叶片衰老的同时，在非生物胁迫（如蔗糖、盐和氧化）下，又能抑制花青素的合成；而拟南芥ANC046既能促进叶片衰老也能促进花青素的合成［14］。在马铃薯（Solanum tuberosum）中，StNAC2对镉胁迫有一定的应答和调节作用［15］。在水稻（Oryza sativa L.）中，过表达OsNAC5可以增大水稻根系的直径，提高对干旱的耐受性，从而增加水稻产量［16］。在豆科植物中间锦鸡儿（Caragana intermedia）中，过表达CiNAC1可促进拟南芥叶片衰老，并且在乙烯处理后与叶绿素降解和衰老相关的基因表达量明显提高［17］。在山葡萄（Vitis amurensis）中，VaNAC26 可以通过上调茉莉酸合成基因和茉莉酸信号通路中的基因表达，提高拟南芥体内的茉莉酸含量来增强对干旱的耐受力［18］。在桃树（Amygdalus persica）中，PpNAC72在桃树果实中高表达，推测该基因可能参与果实成熟［19］。

马尾松（Pinus massoniana）是松科（Pinaceae）松属常绿乔木，具有速生、丰产、适应性强、经济价值高等优良特性，是我国南方最主要的优质针叶用材树种之一［20］。由于我国南方红壤中有效磷含量低，频繁发生干旱、低温等非生物胁迫，使得马尾松造林存活率和生产力降低，造成了严重的经济损失。NAC作为植物特有的一类转录因子，在植物生物和非生物胁迫反应的调控中起着关键作用。而且，现阶段对NAC基因的研究主要集中在模式植物，如拟南芥、水稻和大豆等，对木本植物的研究较为薄弱，尤其是马尾松等针叶树种。因此，对马尾松NAC转录因子进行功能鉴定是必要的。

本研究运用RT-PCR的方法成功克隆了马尾松PmNAC8，对其进行生物信息学分析、亚细胞定位，组织特异性以及在干旱、损伤等非生物胁迫和外源激素方面的响应表达模式分析，以期为马尾松抗逆分子育种提供候选基因资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

马尾松植物材料取自南京林业大学树木园中15年生实生苗和实验室盆栽的30 d幼苗；本氏烟草在光照培养箱中培养，24℃长日照（18 h光照/6 h黑暗），28 d后取长势较好且一致的植株作为试验材料。

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）购自天根生化科技（北京）有限公司；大肠杆菌菌株Trans1-T1感受态、克隆载体pEASY-Blunt Simple购自北京全式金生物技术有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、SMARTer RACE5′/3′Kit和 3′-Full RACE Core Set with PrimeScrip RTase Kit购 自 TaKaRa公 司；DNA marker、Green Taq Mix、Phanta Max Super-Fridelity DNA Polymerase均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；本研究所有引物均由Primer 5软件设计，并由擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 参照TIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，提取30 d盆栽马尾松幼苗全株RNA，所得产物经1.2%凝胶电泳检测，保证RNA完整性，同时，使用超微量紫外分光光度计（NANODROP 2000，ThermoFisher公司）对RNA浓度进行测量，若OD260/280、OD260/230比值为1.8-2.1，说明RNA质量较好。选取2 μg浓度较高且纯度较好的RNA，利用全式金反转录试剂盒反转录合成cDNA第一条链，作为基因克隆的模板。根 据 SMARTer®RACE 5′Kit 和 3′-Full Core Set with PrimeScriptTM RTase试剂盒说明书，合成5′和3′末端模板。

1.2.2 PmNAC8的克隆 从NCBI（national center for biotechnology information）搜索不同植物的NAC序列，与马尾松当年生嫩枝转录组（PRJNA655997）数据［21］相比较，筛选出目的基因，利用Primer Premier 5.0软件设计中间片段引物PmNAC8-Mid（表1）。以马尾松幼苗的cDNA为模板进行PCR反应，总反应体系为 cDNA（50 ng/μL）2 μL、PmNAC8-Mid F 1 μL、PmNAC8-Mid R 1 μL、5×GXL Buffer（Mg2+Plus）10 μL、DNTP Mix-ture 5 μL，ddH2O 补至 50 μL ；反应程序为 98℃ 3 min ；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，35个循环；72℃ 7 min，4℃保存。

以测序获得的PmNAC8中间片段的序列为参照，利用Primer 5.0软件分别设计3′RACE特异性引物 ：3′RACE-PmNAC8-F、3′RACE-PmNAC8-R 以 及5′RACE 特异 性引物 5′RACE-PmNAC8-F、5′RACEPmNAC8-R（表1），分别以 3′-Full Core Set with Prime-ScriptTMRTase 试剂盒和 SMARTer®RACE5′ Kit试剂盒反转录得到的cDNA为模板，分别与接头引物 3′RACE Outer、3′RACE Inner 和 5′RACE Outer、5′RACE Inner进行巢式PCR，各反应均遵循试剂盒说明。将反应产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳验证、回收，与pEASY-Blunt载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，挑取阳性单克隆送上海杰李生物公司进行测序。用Seqman软件拼接序列获得基因全长。

为验证拼接结果的准确性，在序列两端设计引物，分别为：PmNAC8-F和PmNAC8-R（表1），以马尾松cDNA为模板进行PCR反应，产物经连接转化后，送至上海杰李公司进行测序。

1.2.3 PmNAC8的生物信息学分析 利用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 在线预测开放阅读框，确定基因编码序列；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/） 在 线 软件分析氨基酸序列的基本理化性质；利用ExPASy TMpred（https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html） 和 MHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线分析蛋白质的跨膜区和扩膜方向；利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线软件分析预测蛋白质二级结构；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在线预测蛋白质三级结构；利用SignalP-4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在线软件预测蛋白的信号肽；利用Motif Scan（https://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan）在线软件分析蛋白的结构域。

将PmNAC8编码氨基酸序列在NCBI数据库中进行blastp比对，下载blast score较高的氨基酸序列，利用 MEGA X［22］，Evolview（https://www.evolgenius.info/ evolview/） 和 iTOL5.0（https://itol.embl.de/） 在线软件构建系统进化树。

1.2.4 PmNAC8同义密码子偏好性分析 密码子是生物体内遗传信息从DNA到蛋白质准确传递的载体［23-24］。不同生物对密码子的选择具有不同的偏好性，当宿主不具备或仅含有稀少的外源基因密码子时，外源基因的表达可能降低或终止。因此，对密码子使用偏好性进行分析，有助于选择合适的外源表达宿主，保证外源基因顺利表达。利用CodonW软 件（http://codonw.sourceforge.net/）计 算 PmNAC8密码子的使用特性参数，包括A3s、C3s、U3s、GC含量、有效密码子数（effective number of codons，ENc）、密码子中第3位碱基的GC含量（GC3s）、相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）和密码子适应指数（codon adaptation index，CAI）等。运用EMBOSS中的CUSP在线程序计算密码子的使用频率。

拟南芥、烟草（Nicotiana tabacum）、欧洲山杨（Populus tremula）、大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因组密码子使用频率数据来自密码子使用数据库（http://www.kazusa.or.jp/codon）。

1.2.5 马尾松PmNAC8亚细胞定位载体的构建及农杆菌转化 使用Xba I和BamH I酶切瞬时表达载体PBI121-GEP，同时利用高保真酶扩增含有酶切位点的目的基因，上下游引物分别为：PmNAC8-GFP-F和PmNAC8-GFP-R（表1），将PCR扩增产物与双酶切产物回收纯化后重组并转化大肠杆菌，选取阳性菌液送至杰李公司测序。将构建成功的融合表达载体质粒（35S∷PmNAC8-GFP）转化农杆菌GV3101，以只含有GFP标签的质粒农杆菌菌株为对照。将P19菌液与目标菌液等比例混合后按照李尊强等［25］方法将农杆菌重悬液注射于生长状态较好的烟草叶片中，在人工气候培养箱中避光培养48 h后，利用激光共聚焦显微镜LSM710（Zeiss，Jena，Germany）观察GFP融合蛋白的位置。

1.2.6 qRT-PCR分析 为了研究马尾松PmNAC8的表达水平，根据天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书，分别提取了15年生马尾松不同组织及8种处理下30 d幼苗的RNA。利用超微量分光光度计测定总RNA浓度与OD260/280、OD260/230的值并进行凝胶电泳检测其弥散程度（方法同1.2.1），将检测结果符合要求的RNA作为模板进行反转录。8种处理包括非生物胁迫和激素处理，分别是机械损伤、15% PEG6000、10 mmol/L MeJA、50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA和400 μmol/L ABA，其中机械损伤的处理方法是通过切断松针的上半部分、15% PEG6000处理方法是将植物浸泡在溶液中模拟干旱，其他胁迫和处理均采用喷淋植物表面的方式进行［26］。每个处理选择3株长势均匀的幼苗作为3个生物重复，每个植株收集3个样品作为3个技术重复，每隔0、3、6、12和24 h取幼苗针叶作为样品，经液氮速冻后，-80℃保存备用，其中，在0 h收集的样品未经任何处理用作对照组。利用Primer 5.0软件设计实时定量PCR特异性引物Q-PmNAC8-F和Q-PmNAC8-R，以Zhu等［27］筛选出的马尾松较稳定的Tubulin alpha（GenBank登录号：KM496535.1）作为内参基因，并设计内参引物（表1），进行定量PCR反应。将得到的cDNA模板稀释20倍，备用。反应体系和反应程序参考 Hieff UNICON®qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书。反应结束后，将数据导出，参照2-ΔΔCT法计算该基因的相对表达量，使用Microsoft Office Excel 2019和GraphPad Prism 8.0等软件进行数据分析及基因表达图的绘制。

1.2.7 启动子克隆和序列分析 根据在马尾松近缘物种火炬松基因组数据库检索到的PmNAC8启动子序列，设计2条特异性引物GSP1和GSP2（表1），利用天根植物基因组提取试剂盒提取15年生马尾松基因组DNA，按照TaKaRa生物公司染色体步移技术试剂盒进行PCR扩增，将PCR产物经电泳检测，回收清晰条带，连接克隆载体pEASY-Blunt，转化大肠杆菌，挑选正确的单克隆扩大培养后送至上海杰李生物公司测序。根据测序序列设计特异性引物PmNAC8-Pro（表1），以马尾松基因组DNA为模板克隆启动子全长。

表1 本研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

利 用 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线软件预测PmNAC8的启动子内部顺式作用元件。

2 结果

2.1 PmNAC8的克隆与序列分析

根据马尾松转录组数据库中找到的目的基因的EST序列［21］，设计特异性引物后，依次进行中间片段扩增、3′RACE扩增、5′RACE扩增，之后利用SeqMan软件拼接获得该基因的全长cDNA序列1 726 bp，为验证拼接结果的正确性，对其全长及ORF区域进行扩增（图1）。测序结果显示拼接结果正确，该基因的ORF为1 209 bp，3′端序列148 bp，5′端序列369 bp，预测其可编码402个氨基酸，且具有NAC蛋白特有的NAM结构域，因此将其命名为PmNAC8，基因登录号为MZ291447。

图1 马尾松PmNAC8的全长及ORF的扩增Fig.1 Full-length and ORF amplification of PmNAC8 gene in P.massoniana

2.2 PmNAC8的生物信息学分析

2.2.1 蛋白理化性质及跨膜区预测分析 将PmNAC8序列通过NCBI在线软件进行ORF预测发现，其含有开放阅读框1 209 bp，编码402个氨基酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。通过Motif Scan在线分析PmNAC8蛋白的结构域，显示在其58-191位氨基酸序列是NAC蛋白特有的NAM结构域，其E-value值为2.80E-26，说明其属于NAC转录因子（图2-A）。

利用ExPASy ProtParam在线软件预测蛋白质的理化性质，结果表明，PmNAC8蛋白由碳、氢、氧、氮、硫5种元素组成，总分子式为C1941H3011N559O639S20，分子量为45 042.82 Da，由402个氨基酸残基组成，理论等电点为5.11，其中带正电荷（Arg+Lys）的氨基酸残基数为43，带负电荷（Asp+Glu）的氨基酸残基数为65。利用ProtScale在线软件进行蛋白疏水性分析，其中横坐标为蛋白质氨基酸残基，纵坐标为该位点氨基酸残基疏水性值，正值表示疏水性氨基酸，负值表示亲水性氨基酸。结果显示，分值为负的氨基酸多于分值为正的氨基酸，即亲水大于疏水，因此，推测PmNAC8蛋白为亲水性蛋白（图2-B）。通过在线软件SignalP预测PmNAC8蛋白信号肽，结果表明，该蛋白不存在信号肽（图2-C）。

图2 PmNAC8蛋白的生物信息学分析Fig.2 Bioinformatics analysis of PmNAC8 protein

通过ExPASy TMpred和TMHMM在线软件预测分析蛋白跨膜区、扩膜方向。结果（图3-A、B）表明，PmNAC8蛋白为非跨膜蛋白。

图3 PmNAC8蛋白跨膜区的预测分析Fig.3 Transmembrane region prediction of PmNAC8 protein

2.2.2 蛋白二级结构、三级结构预测 利用SOPMA在线预测分析蛋白的二级结构。结果（图4-A）表明，PmNAC8蛋白的二级结构由无规则卷曲（Cc）、α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）和β-折叠构成。其中，无规则卷曲有251个氨基酸，占序列的62.44%；α-螺旋有70个氨基酸，占序列的17.41%；延伸链有61个氨基酸，占序列的15.17%；β-折叠有20个氨基酸，占序列的4.98%。通过SWISS-MODEL网站使用同源建模法在线预测蛋白质的三级结构（图4-B）。

图4 PmNAC8蛋白二级（A）、三级（B）结构预测Fig.4 Secondary（A）and tertiary（B）structure predictions of PmNAC8 protein

2.2.3 系统进化树分析 利用进化树设计软件MEGA5.0采用邻接法（neighbor-joining，NJ），设置参数自展值（Bootstrap值）为1 000次进行进化分析，结果（图5）表明，马尾松的NAC蛋白与火炬松、北美云杉的遗传距离较近，说明它们在进化的过程中亲缘关系较为密切，而与其他双子叶植物的遗传距离较远，说明与双子叶植物的NAC蛋白在进化过程中亲缘关系较远。

图5 PmNAC8蛋白系统发育进化树Fig.5 Phylogenetic analysis of PmNAC8 protein

2.3 PmNAC8密码子偏好性分析

2.3.1 GC、GC3s、ENc和CAI分析 利用CondonW程序分析PmNAC8密码子的CAI值、ENc值，同时运用EMBOSS中的CUSP在线程序计算总GC含量以及GC3s有效密码子数［28］。结果（表2）可知，PmNAC8基因的ENc值为50.19，ENc值偏大，说明PmNAC8在编码氨基酸时密码子使用偏好性较弱，表达水平相对较低。CAI值为0.187，进一步表明PmNAC8对密码子的选择偏好性较弱。GC含量和GC3s值分别为31.10%和42.50%，说明密码子偏好以A/T结尾。

表2 PmNAC8密码子选择偏好性参数Table 2 Codon selection preference parameters of PmNAC8 gene

2.3.2 相对同义密码子使用度 在马尾松PmNAC8的密码子中，有29个密码子的RSCU值大于1（表3），为马尾松PmNAC8偏好密码子，并且其中有23个密码子是以A/T结尾；其中偏好性较强的有UCA、GCA和UGA（RSCU＞2.0）；然而编码甲硫氨酸（Met）的密码子ATG、编码色氨酸（Trp）的密码子TGG、编码亮氨酸（Leu）的密码子CTC以及编码异亮氨酸（Ile）的ATA，其RSCU值均等于1，表明马尾松PmNAC8基因对Met、Trp、Leu和Ile的使用没有偏好性。大多数G或C碱基结尾的密码子的RSCU值和Fraction值均较低，表明这些密码子在该基因中的使用频率较低。

表3 PmNAC8同义密码子相对使用度Table 3 RSCU of PmNAC8 gene

2.4 PmNAC8外源宿主的选择

将PmNAC8密码子使用频率分别与拟南芥、烟草、酿酒酵母、大肠杆菌和欧洲山杨基因组密码子的使用频率进行分析比较（表4），将比值大于或等于2.0和小于或等于0.5的密码子作为筛选标准统计差异个数。结果表明，PmNAC8与烟草、拟南芥和欧洲山杨3种模式植物之间的绝大部分密码子使用偏好性差异较小，其中，与烟草、拟南芥、欧洲山杨基因组密码子的使用频率差异较大的分别有12、14和13个，说明在PmNAC8遗传转化试验中，烟草更适合作为异源表达的受体。与3种植物相比，PmNAC8与大肠杆菌和酿酒酵母2种微生物的基因组密码子偏好性差异较大，尤其与大肠杆菌密码子偏好性差异很大，而与酿酒酵母密码子偏好性差异小于大肠杆菌，可能由于酿酒酵母为真核生物，而大肠杆菌为原核生物，可见，相较于大肠杆菌，酵母更适合PmNAC8微生物内异源表达。

表4 PmNAC8与部分模式生物基因组密码子使用偏好性比较Table 4 Comparison of codon usage preference between PmNAC8 and other model organisms

续表Continued

2.5 PmNAC8亚细胞定位试验结果

构建PBI121-PmNAC8-GFP基因的融合表达载体，以空载体PBI121-GFP为对照，利用烟草瞬时表达系统，通过农杆菌将载体转入烟草叶片中，在人工气候培养箱中避光培养48 h后，利用激光共聚焦显微镜LSM710观察GFP融合蛋白的位置。由图6可知，PmNAC8蛋白质主要定位在细胞核中，而对照组细胞核、细胞膜和细胞质中均能观察到绿色荧光信号。

图6 PmNAC8亚细胞定位结果Fig.6 Subcellular localization results of PmNAC8

2.6 PmNAC8的组织特异性表达分析

利用实时荧光定量PCR技术分析了PmNAC8在15年生马尾松不同组织中的表达情况。结果（图7）表明，PmNAC8在花、幼叶、老叶、幼茎、老茎、根、木质部和韧皮部中均有表达，但表达水平不同，在根中的表达水平显著高于在其他组织，是花的21.4倍，是幼叶和老叶的9.0倍和7.6倍。因此，PmNAC8主要在马尾松的根中表达。

图7 马尾松PmNAC8在不同组织中的表达水平Fig.7 PmNAC8 expression level in the different tissues of P.massoniana

2.7 PmNAC8在非生物胁迫下的表达分析

以 10 mmol/L MeJA、50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA、15% PEG6000、机械损伤和400 μmol/L ABA处理后的30 d马尾松盆栽幼苗cDNA为模板，检测PmNAC8在胁迫处理下表达情况（图8）。在10 mmol/L MeJA和15%PEG6000处理下PmNAC8表达量均受到显著抑制，在3 h时表达量约为对照组的1/2和1/4，胁迫至6h后表达量几乎完全被抑制。在50 μmol/L ETH、10 mmol/L H2O2、2 mmol/L GA、1 mmol/L SA、损伤和400 μmol/L ABA处理下，PmNAC8表达量总体呈现先升高后降低的趋势。在ETH、H2O2、GA、SA处理下，PmNAC8均在3 h时表达量最大，与对照组差异显著，分别是对照组的1.13、1.86、6.89和1.15倍，其中在2 mmol/L GA处理下PmNAC8的表达量显著高于对照组和其他胁迫组。在损伤和ABA处理下，PmNAC8的表达量分别在6和12 h时最高，与对照组差异显著，分别是对照组的1.62和1.30倍。

图8 马尾松PmNAC8在不同胁迫下的表达水平Fig.8 PmNAC8 expression of P.massonniana under different stress

2.8 PmNAC8启动子顺式作用元件分析

为明确PmNAC8启动子是否具有活性，克隆了PmNAC8上游1 492 bp启动子序列（图9），命名为PmNAC8-Pro。PlantCARE分析显示，该启动子除含有TATA-box（21个）、CAAT-box（34个）等核心启动子元件和光响应元件（6个）以外，还包含与非生物胁迫相关的元件，如参与干旱诱导的MYB结合位点MBS（1个）、抗氧化反应元件ARE（2个），以及植物激素相关响应元件，如赤霉素响应元件（1个）（表5）。基于上述结果，推测马尾松PmNAC8启动子可能参与调控非生物胁迫以及响应植物激素胁迫的功能。

表5 PmNAC8启动子中的顺式作用元件Table 5 Cis-acting elements in the PmNAC8 promoter

图9 PmNAC8启动子扩增电泳Fig.9 Amplification electrophoresis of PmNAC8 promoter

3 讨论

NAC是植物特有的一类转录因子，是植物长发育及适应环境胁迫的重要转录调节因子。许多研究表明，NAC转录因子家族在植物中具有不可替代的生物学功能，如叶片衰老［29］、果实成熟［30］、胚珠发育［31］、逆境胁迫应答［32］和激素信号转导［33］等。目前，对NAC转录因子的报道主要集中在模式植物中，如拟南芥、水稻、玉米等，有关马尾松NAC家族基因功能的研究和报道较少。本研究从马尾松中克隆了PmNAC8，将其编码的氨基酸序列与其他物种NAC进行比对，结果表明，PmNAC8蛋白具有NAC转录因子家族典型的NAM结构域，N端具有150 bp组成的高度保守序列，C端具有高度特异性。另外，蛋白质的二级结构是其整个空间结构的基础，在蛋白质折叠过程的早期形成，为蛋白质三级结构的形成奠定基础，对亚细胞定位有一定作用［34］，预测PmNAC8蛋白的二级结构发现主要以无规则卷曲结构为主，这与大多数NAC蛋白二级结构相似。系统进化树结果表明其编码的蛋白与火炬松、北美云杉高度同源。对PmNAC8蛋白结构分析发现，其为亲水性蛋白，且不存在信号肽，与大多数植物NAC蛋白相似［35］。亚细胞定位结果表明，PmNAC8定位于细胞核，属于典型的核蛋白，表明PmNAC8可能在细胞核中发挥重要功能。

探究PmNAC8基因密码子偏好性，可以揭示其基因的密码子组成特性，为深入研究PmNAC8的功能提供依据。本研究利用生物信息学的方法对PmNAC8的密码子偏好性进行分析，结果表明，该基因有29个密码子的RSCU值大于1，其中23个密码子是以A/T结尾，且该基因GC含量和GC3s值分别为31.10%和42.50%，这一结果均符合马尾松基因总体上偏好第3位碱基为A/T密码子的特征［36］。烟草、拟南芥、欧洲山杨等模式植物常用于基因功能的探究，大肠杆菌常作为基因的原核表达系统受体，而酵母菌常被用于真核系统受体，由于马尾松转基因平台尚未构建成功，因此，需要借助相应遗传转化体系进行异源表达。在异源表达过程中，为实现外源基因的成功表达并提高其表达量，应尽量选择密码子使用偏好性差异较小的作为受体，本研究通过比较PmNAC8与拟南芥、烟草、欧洲山杨、酿酒酵母、大肠杆菌的基因组密码子使用频率的差异，发现酵母真核表达系统更适合作为PmNAC8基因的表达系统，而烟草相较于拟南芥和欧洲山杨更适合作为PmNAC8的异源表达受体。

本研究对马尾松PmNAC8进行qRT-PCR分析发现，该基因在植物不同组织中均有表达，但在根中的表达水平明显高于其他组织，其次是老茎和幼茎。同时，PmNAC8受损伤及植物激素GA、ABA的诱导表达，推测该基因可能参与植物非生物胁迫和激素的应答调控。启动子影响外源基因的表达水平，是基因工程表达载体的一个重要元件，对基因的调控具有重要意义［37］。如水稻Os08PTS启动子序列能够调控Os08PTS基因在水稻茎和种子胚中表达，驱动下游基因转录［38］；谷子膜结合NAC家族基因SiNAC启动子参与生长素、甲基茉莉酸和氧化胁迫应答［39］等。本研究以马尾松为材料经染色体步移法克隆了马尾松PmNAC8启动子，长度为1 492 bp。序列分析发现PmNAC8-Pro启动子序列中包括多种光响应元件、生物胁迫响应元件及植物激素相关响应元件，如赤霉素（GA）响应元件，且序列分析结果与qRT-PCR结果一致，推测PmNAC8可能受到非生物胁迫和激素等的诱导响应。

4 结论

从马尾松中克隆出一个新的NAC基因PmNAC8，全长1 726 bp，编码402个氨基酸，其编码蛋白质分子量为45 042.82 Da，等电点为5.11，属于亲水性蛋白，且不存在信号肽，有明显的NAM结构域，属于典型的NAC转录因子家族成员；密码子使用偏性较弱，偏好使用A/T结尾的密码子；酵母真核表达系统较大肠杆菌原核表达系统更适合PmNAC8异源表达，模式植物烟草较拟南芥和欧洲山杨更适合做PmNAC8的遗传转化受体。该蛋白定位在细胞核内，与火炬松、北美云杉同源性较高；PmNAC8在植物不同组织中均有表达，可能参与植物非生物胁迫和激素的应答调控。