大豆耐盐种质的筛选及其耐盐生理特性分析

石广成 杨万明 杜维俊 王敏

（1.山西农业大学农学院，太谷 030801；2.晋中学院生物科学与技术学院，榆次 030600）

土壤盐渍化导致全球耕地面积不断的减少，并极大程度限制着作物产量和品质的提高［1］。我国盐渍土分布十分广泛，其面积已经超过9 000 万hm2，而且由于全球气温的升高，人们对化肥的不合理使用，以及环境污染，使土壤盐渍化越来越严重，对我国农业发展造成了严重的威胁［2］。栽培大豆属于中度耐盐农作物，它所能够承受的土壤盐度阈值为5.0 ds/m，如果土壤的盐度从5.0 ds/m提升至10.2 ds/m时，大豆植株的死亡率和叶片的坏死将大大的提升，叶缘卷曲、叶片枯萎黄化或者叶片缺绿，最终导致大豆产量和品质下降，其中盐敏感品种所受的影响比耐盐品种更大［3］。因此，对耐盐品种的筛选是应对盐碱土壤危害的一个有效措施。

不同的大豆品种之间，其耐盐性存在差异［4-5］，为挖掘大豆种质资源的耐盐品种，邵桂花等［6］通过咸水浇灌大田，对1 716份大豆品种进行耐盐性鉴定，筛选出了85-140、早熟6号等敏盐品种和铁丰8号、文丰7号等耐盐品种。刘光宇等［7］通过水培法利用100 mmol/L NaCl对29份大豆胁迫处理，进行耐盐性鉴定。牛远等［8］利用徐豆14、临豆10、中黄55和合豆3号大豆为试验材料，通过不同的盐浓度对大豆芽期和苗期生长的影响，评价了不同大豆品种的耐盐能力。罗庆云等［9］用石英砂作为基质，通过浇含有不同浓度NaCl的营养液进行胁迫处理，鉴定了6个大豆品种的耐盐特性。Valencia等［10］在光照培养箱中通过液营养水培法鉴定出Lee68等耐盐品种。Lee等［11］在温室中使用100 mmol/L NaCl，利用土培法对14个大豆品种进行鉴定，鉴定出了PI506820、Hartwing等5个耐盐品种。本研究采用致死浓度作为苗期大量材料的耐盐性初筛，方法更为简单。

盐渍土对植物的主要影响表现为降低植物种子发芽率、出苗率以及成活率和生物量积累，使植物叶片失绿甚至提前死亡［12］。盐渍土对植物产生渗透胁迫和离子胁迫以及氧化胁迫，而这些胁迫主要是由于Na+和Cl-在植物不同组织中不断积累，影响膜的渗透性，从而改变了植物对离子的吸收，导致离子吸收不平衡，进而对植物的生长产生了一系列的毒害作用［13］。大豆耐盐性的强弱可以体现在植株不同的形态和生理响应之上。不同研究者采用不同指标对耐盐性进行评价。张翠平等［14］通过对不同大豆品种叶片光合指标，鉴定了18份大豆品种的耐盐性。张海波等［15］利用150 mmol/L NaCl胁迫后，对不同大豆品种表型测定以及MDA、SOD和游离Pro的含量变化，比较了4个不同大豆品种的耐盐性。

由于耐盐性鉴定条件和指标众多，确定较为困难，使得耐盐机理研究不够深入。本研究通过致死浓度的方法对332份材料进行耐盐性初筛，并结合表型性状和生理性状等指标进行全面评价，试图探寻不同耐盐性大豆品种的形态和生理响应。同时期望能够挖掘更多的大豆耐盐性种质资源为大豆耐盐育种提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试332份大豆种质材料由山西农业大学大豆育种室提供，以国际公认耐盐品种Lee68和敏盐品种Jackson作为对照材料。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验方法采用王聪等［16］方法进行，具体如下：将大豆种子播种于50穴的育苗盘中，以蛭石作为基质，每穴2株，3次重复，采用随机区组设计。待到真叶完全展开后对其进行NaCl胁迫处理。将NaCl溶于1/4的Hoagland营养液之中，每隔2 d浇液1次，每个育苗盘浇1.5 L。胁迫的起始浓度为70 mmol/L，以后每次更换营养液时以30 mmol/L递增，为了更准确地评价该品种的致死浓度，当NaCl浓度达到190 mmol/L时，每次浇液以10 mmol/L递增，然后统计各个品种的致死浓度（植株2/3以上叶片黄化、萎蔫即可视其为死亡，死亡时浓度视为该品种的致死浓度）。以敏盐品种Jackson和耐盐品种Lee68的致死浓度作为参考标准，对不同的大豆品种进行耐盐性分类。

根据初筛结果，分别从不同的耐盐等级中各选择1个代表性品种，以耐盐品种Lee68和敏盐品种Jackson作为对照品种。根据品种在不同浓度下的表现及刘谢香等［17］的耐盐性鉴定方法，选择浓度为150 mmol/L NaCl溶液胁迫处理。将品种播种于盛有蛭石的花盆中，每盆播种5粒，再覆盖1 cm蛭石。待子叶完全展开后间苗，每盆留苗2株。待真叶完全展开后进行处理，以60 mL 150 mmol/L的NaCl溶液胁迫处理，等量清水为对照，每2 d浇液一次，共浇5次后取材，对各项指标进行测定。

1.2.2 测定指标及方法

1.2.2.1 形态性状的测定 将植株从基质中取出，洗净其上的基质，用滤纸吸干表面的水分。用卷尺测量植株的根长和株高。然后将样品置于105℃杀青15 min，调至80℃烘干至恒重，分别称量其地上部和地下部干重。

1.2.2.2 植物离子含量的测定 将烘干的植株根、茎、叶分别称取0.05 g，用研钵磨成粉末状，样品处理参考王宝山等［18］的方法。将样品加入一定量的去离子水中，100℃水浴锅中煮沸1.5 h，冷却后定容，6 000 r/min离心5 min，上清液用于离子测定。取10 mL样品上清液定容至100 mL，使用6400A 型火焰光度计测定Na+、K+的含量。参考雷启福等［19］和周强等［20］的方法取 5 mL 样品上清液，加入2 mL硝酸溶液（V浓硝酸∶V水=1∶1）和2 mL丙酮，使用5 mg/mL硝酸银溶液定容至25 mL，使用UV1100紫外可见光分光光度计测定Cl-含量。

1.2.2.3 叶片SPAD值的测定 用SPAD-502型叶绿素测定仪测定大豆植株叶片叶绿素的含量。每盆植株选2片真叶的3个不同部位进行测定，3次重复。

1.2.2.4 光合指标的测定 在上午9点至下午13点，使用LI-6400型便携式光合作用测定系统，测定5个大豆品种的幼苗叶片光合气体交换参数，主要包括净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳（Ci）及蒸腾速率（Tr）。采用固定红蓝光源进行试验，光强为1 200 μmol/m2/s，温度25℃，空气流速为0.5 L/min，相对湿度60%，3次重复。

1.2.2.5 数据分析 数据统计采用Excel 2007，差异显著性分析采用DPS9.01软件进行相关的统计分析。

2 结果

2.1 NaCl胁迫下不同大豆品种的表型分析

在332份栽培大豆供试品种中，致死浓度为250 mmol/L时的品种数量最多，共计83份，占总材料的25%；其次是致死浓度为240 mmol/L时的品种，共计70份，占总材料的21.1%。致死浓度为190 mmol/L的敏盐材料2份，占0.6%；致死浓度为为270 mmol/L的品种15份，占4.5%；致死浓度为280 mmol/L的耐盐品种3份，占0.9%（图1）。结果表明，大豆品种间的耐盐差异性比较大，中度耐盐品种占比最大。致死浓度鉴定结果在所测资源中基本呈正态分布。

图1 不同浓度NaCl处理后332份栽培大豆死亡情况Fig.1 Death of 332 cultivated soybeans treated with different concentrations of NaCl

本试验中敏盐品种Jackson的致死浓度为200 mmol/L，筛选出较Jackson更为对盐胁迫敏感的材料2份，分别为陕西八月黄和中黄80，筛选出与Jackson对敏盐程度相当的材料3份，分别为天鹅蛋、岢岚黄豆和荷豆15。本试验中耐盐品种Lee68致死浓度为270 mmol/L，筛选出较Lee68更耐盐的材料3份，分别为沁源大黑豆、运城扁黑豆和农科6号，筛选出与Lee68耐盐程度相当的材料14份，其中4份为育成品种，8份地方品种，2份本实验室育成的品系。这些材料可作为耐盐性研究和耐盐育种的基础材料（表1）。

表1 不同大豆品种的NaCl致死浓度Table 1 Lethal concentrations of NaCl in different soybean varieties

通过致死浓度鉴定后，分别选择耐盐级别不同的3个品种进行进一步的鉴定。不同耐盐品种在150 mmol/L NaCl胁迫10 d后的表型症状见图2。敏盐品种陕西八月黄和Jackson的叶片枯黄卷曲严重，中度耐盐品种晋大70叶片只有小部分失绿，高度耐盐品种汾豆105和Lee68保持正常的生长，并未看到有相应的盐害症状。

图2 150 mmol/L NaCl胁迫下大豆品种苗期表型症状Fig.2 Phenotypic symptoms of soybean varieties at seedling stage under 150 mmol/L NaCl stress

2.2 NaCl胁迫对大豆苗期干重、株高及根长的影响

在150 mmol/L的NaCl胁迫下所有大豆品种植株干重、株高及根长均低于对照，说明150 mmol/L NaCl胁迫对这5个大豆品种的生长均产生了抑制作用。汾豆105的相对干重、相对株高和相对根长均显著高于陕西八月黄和晋大70，且晋大70显著高于陕西八月黄（表2）。说明汾豆105的耐盐性最强，晋大70次之，陕西八月黄耐盐性最弱，其与致死浓度鉴定结果相一致。表明致死浓度鉴定可以作为一种快速有效的耐盐性鉴定手段。另外汾豆105的相对干重和相对根长均显著高于国际公认耐盐材料Lee68，而陕西八月黄的相对株高和相对根长均显著低于国际公认敏盐材料Jackson。这两个材料可以作为耐盐性研究的基础材料。

表2 NaCl胁迫对大豆植株干重、株高及根长的影响Table 2 Effects of NaCl stress on the plant dry weight，plant height and root length of soybean

2.3 NaCl胁迫对大豆苗期不同部位离子含量的影响

2.3.1 NaCl胁迫对Cl-分布的影响 植物吸收过量Cl-，会造成离子毒害现象，导致大量细胞死亡，进而抑制植物生长。在本研究中，盐胁迫后大豆植株的根、茎和叶中的Cl-相较于对照都有不同程度升高。在根中，陕西八月黄和晋大70的Cl-分别上升5.51%和8.82%，相较于对照，变化不显著；汾豆105相较于对照，在根中的Cl-上升了243.04%，显著高于对照；Lee68和Jackson与对照相比均显著上升，分别上升了107.66%和96.21%。在茎中陕西八月黄、晋大70、汾豆105、Jackson和Lee68的Cl-含量均显著上升，分别上升了396.67%、296.09%、226.94%、372.26%和177.96%，就其上升幅度而言，陕西八月黄＞Jackson＞晋大70＞汾豆105＞Lee68。在叶中，陕西八月黄、晋大70、汾豆105、Jackson、Lee68和汾豆105相较于对照均呈显著关系，其中Jackson上升幅度最大，上升745.90%，陕西八月黄次之，上升498.35%；汾豆105上升幅度最小，上升239.29%（图3）。

图3 盐胁迫下各大豆品种苗期不同组织中Cl-含量分析Fig.3 Analysis of Cl- content in different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.3.2 NaCl胁迫对Na+分布的影响 植物细胞中的Na+离子过多时，它会取代原细胞膜上的钙离子，使膜产生渗漏现象，使核酸和蛋白质的合成分解平衡受到破坏，从而影响着植物的生长与发育。本研究中，盐胁迫后大豆不同品种的不同组织中Na+均有不同程度的上升。在根中耐盐品种Lee68和汾豆105的上升幅度最大，分别上升了323.31%和200.51%；晋大70的上升幅度次之；敏盐品种陕西八月黄和Jackson上升幅度最小，分别上升了112.80%和121.58%。在茎中不同组织的Na+的变化趋势与在根中的变化趋势相似，上升幅度较根大。在叶中，Na+的上升幅度的变化规律与根和茎相反，耐盐品种Lee68和汾豆105的上升幅度最小，晋大70次之，敏盐品种Jackson和陕西八月黄的上升幅度最大，分别上升了403.34%和592.02%（图4）。

图4 盐胁迫下各大豆品种苗期不同组织中Na+含量分析Fig.4 Analysis of Na+ content in the different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.3.3 NaCl胁迫对K+分布的影响 植株K+可以提高其抵御盐胁迫的能力，充足的K+可以维持较高K+/Na+，对于避免盐胁迫植物生长受到抑制具有重要意义。在本研究中，盐胁迫后大豆的根和茎组织的K+含量相较于对照而言均有不同程度的下降。其中在根组织中除Lee68与对照呈不显著关系（P＜0.05），其它均显著降低，其中高度耐盐品种汾豆105下降了27.93%、中度耐盐品种晋大70下降了29.80%、敏盐品种陕西八月黄下降了30.18%，Jackson下降了52.75%；在茎中，敏盐品种陕西八月黄、Jackson，以及中度耐盐品种K+含量均下降，耐盐品种汾豆105和Lee68均有不同程度的上升其中汾豆105与对照呈显著关系（P＜0.05），Lee68上升不显著；在叶中，除高度耐盐品种汾豆105的K+上升不显著其余均显著上升（图5）。

图5 盐胁迫下各大豆品种苗期不同组织中K+含量分析Fig.5 Analysis of K+ content in different tissues of soybean varieties at seedling stage under salt stress

2.4 盐胁迫对不同品种大豆叶片光合特性的影响

在150 mmol/L NaCl胁迫处理后，不同大豆品种相较于对照，SPAD均有显著性的变化（表3）。其中陕西八月黄和Jackson在盐胁迫后，SPAD值分别为20.56和27.37，相比对照分别下降了31.29%和17.94%；而晋大70、汾豆105和Lee68的SPAD值相较对照均上升，分别上升1.80%、7.60%和15.89%。表明耐盐品种在盐胁迫下SPAD值上升幅度大，中等耐盐品种表现出SPAD值小幅上升，而敏盐品种表现出SPAD值下降。

表3 NaCl胁迫对不同大豆品种光合指标的影响Table 3 Effects of NaCl stress on photosynthetic indices of different soybean varieties

不同品种的大豆叶片净光合速率（Pn）在盐胁迫后均显著低于对照，相较于对照而言，Lee68和汾豆105下降幅度最低，分别下降了37.19%和49.21%。Jackson和陕西八月黄下降幅度最高，分别为96.66%和80.06%。除Jackson外，其他品种的胞间CO2浓度（Ci）相较于对照均显著下降。不同大豆品种叶片蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）相较于对照均显著降低，其中Lee68的下降幅度最低，其次是汾豆105，其他3个品种下降幅度较高，均高于80%。

3 讨论

3.1 致死浓度鉴定的可靠性

大豆耐盐种质筛选和大豆耐盐生理研究对于实践生产具有重要的意义。国内外学者采用了不同的方法对大豆苗期的耐盐性进行了评价鉴定。邵桂花等［21］通过抽取地下咸水和地上的淡水配置成灌溉用的盐水，建立了以叶片盐害症状评定大豆耐盐性的田间鉴定方法。该方法方便快捷，适用于大批量的种质鉴定。但田间灌溉会导致盐分分布不均匀，而且容易受气温、地力、降水、日照和风力的影响。罗庆云等［22］利用水培的方法对大豆苗期的品种进行耐盐性鉴定。该研究发现盐胁迫降低了种子的出苗速率，影响了幼苗的正生长，但是需要多次的更换营养液，费时费力。本研究将蛭石作为基质，致死浓度作为评价指标进行大豆耐盐性筛选，在遮雨棚下利用自然光温条件进行大豆种质资源的耐盐性鉴定。与田间鉴定法相比较，该方法不受地力、降水等影响。同时，蛭石吸水迅速，有利于保持土壤盐分的相对稳定，而且此种方法相较于水培法，更接近于大豆生长的实际环境情况，且鉴定方法较为简便、经济、快速。就其鉴定结果而言，其中致死浓度最低是190 mmol/L，致死浓度最高为280 mmol/L，这与张玉梅等［23］报道相一致，即不同大豆品种之间的耐盐性差异很大。在此基础上，用表型性状（干重、株高和根长）、生理指标（植株不同组织中Na+、K+、Cl-及叶片的相对电导率）以及光合指标（SPAD、Pn、Ci、Tr和Gs）为评价指标，对耐盐级别不同的3个大豆品种陕西八月黄（敏盐）、晋大70（中度耐盐）、汾豆105（耐盐）进行了进一步的鉴定。结果表明汾豆105较其余两个有较强的耐盐性，晋大70次之，陕西八月黄的耐盐性最弱。上述鉴定结果与致死浓度鉴定结果一致，说明致死浓度作为大豆苗期耐盐性鉴定评价指标是可靠的，可用其进行大批量大豆种质耐盐性筛选。

3.2 NaCl胁迫对大豆苗期离子含量的影响

盐胁迫是通过离子毒害、渗透胁迫以及营养不平衡3个方面影响植株的生长［24］。其中离子毒害和渗透胁迫对植物伤害最为严重，不仅影响植物对离子的选择性吸收，而且还会扰乱植物体内离子平衡，导致植物生理紊乱。其中植物不同部位离子浓度的变化是其直接的表现［25］。有研究认为，耐盐大豆拒Na+主要通过根部组织和茎部组织［26］。於丙军等［27］得出耐盐大豆的根部和茎部不仅拒Na+，而且还拒Cl-。在本研究中也发现了类似的规律，结果发现耐盐品种汾豆105、Lee68和晋大70的根组织对于Na+的吸收相对较多，通过茎运输到叶片中较少，主要积累在根茎之中。茎和叶的Na+/K+值较低。对于敏盐品种陕西八月黄和Jackson，其根部Na+的增幅较小，通过茎部组织在叶中积累较多，叶中的Na+/K+比较高。对于Cl-在不同组织中的分布规律与Na+相类似。敏盐品种陕西八月黄和Jackson的Cl-在叶中增幅较大，而在根中Cl-的增较小，对于耐盐品种而言与其相反。

3.3 NaCl胁迫对大豆苗期光合性能和SPAD的影响

植物光合作用对外界环境条件的改变非常敏感，它会随着生长环境的变化而发生改变。NaCl胁迫对植物光合作用会产生很大的影响，当植物受到盐胁迫后，会导致叶片失水，气孔关闭，二氧化碳供应不足，进而导致光合反应下降［28-29］。盐胁迫对植物光合的影响主要是气孔限制和非气孔限制。但是气孔限制还是非气孔因素现在存在争论［30］。一般认为，在盐胁迫下植物的净光合速率下降，气孔导度下降，而胞间二氧化碳的浓度下降，这种情况视为气孔限制。反之，如果叶肉细胞的光合能力下降，即使气孔导度下降，胞间二氧化碳的浓度也会上升或者不变［31］。在本研究中，盐胁迫下5个大豆品种的净光合速率（Pn）、胞间二氧化碳浓度（Ci）、叶片蒸腾速率（Tr）和气孔导度（Gs）几乎均有不同程度的下降。净光合速率最能够直接反映出植物单位叶面积的物质生产能力［32］。敏盐品种陕西八月黄和Jackson的净光合速率下降幅度均大于耐盐品种汾豆105、晋大70和Lee68。主要由于耐盐品种较敏盐品种更能够有效的避免Na+和Cl-进入到叶片之中，以维持较高的光合特性，使耐盐大豆植株能够正常生长［33］。对于叶绿素（SPAD）而言，除陕西八月黄和Jackson相对于对照下降外，其余均小幅度的上升。可能是由于耐盐品种Lee68、汾豆105和晋大70的根和茎阻拒了大量的Na+、Cl-，使流向叶片的离子减少，叶片受的影响较小，进而对植株的光合作用影响较小，而敏盐品种Jackson和陕西八月黄的根阻滞能力较小，使大量的Na+和Cl-流向植株叶片，活性氧大量的积累导致氧化破坏，加快了叶绿素的降解［34］。综上，说明不同耐盐等级品种的不同组织离子积累情况，直接影响着植物的光合作用。

4 结论

以NaCl致死浓度为评价指标，从332份大豆种质资源筛选出6份敏盐材料和18份耐盐材料。在150 mmol/L NaCl胁迫下，大豆植株的干重、株高和根长均下降，耐盐品种较与敏盐品相比下降幅度小；耐盐品种植株根和茎对Na+和Cl-的积累较多，叶中积累较少，而敏盐品种与其相反；耐盐品种汾豆105、Lee68和晋大70的SPAD上升，而敏盐品种Jackson和陕西八月黄的SPAD均下降；不同品种的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均显著下降，其中敏盐品种下降幅度大于耐盐品种。