暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

刘兆瑞, 吴 涵, 郭晓昌, 李亚子, 赵 丹,*, 郭 巍,2,*

(1. 河北农业大学植物保护学院， 河北保定 071001; 2. 中国农业科学院研究生院, 北京 100081)

几丁质是昆虫表皮、围食膜和气管的重要组成成分，为防止昆虫脱水以及病原物的侵染提供物理屏障，在昆虫生长发育中起重要作用(Merzendorfer and Zimoch, 2003; Zhuetal., 2016; Muthukrishnanetal., 2019)。由于在包括人在内的哺乳动物和高等植物中不存在几丁质，几丁质代谢相关蛋白则成为设计绿色杀虫剂的理想分子靶标(张建珍, 2014; Liuetal., 2019a)。几丁质持续的合成与降解保证昆虫的正常生长发育，其过程需要几丁质代谢酶的协同作用，从而维持几丁质的动态平衡(Zhuetal., 2016; Liuetal., 2019b; Muthukrishnanetal., 2019)。昆虫体内几丁质的合成起始于海藻糖，经一系列的生理生化反应，最终由几丁质合酶将UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UAP-GlcNAc)催化形成几丁质(Katoetal., 2002; 刘晓健等, 2019)。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)是UAP-GlcNAc生物合成中的关键酶，在昆虫变态发育过程中发挥着重要作用(Arakaneetal., 2009, 2011; Liuetal., 2019a)。

在昆虫中，基于多种昆虫基因组测序的完成，发现在不同昆虫中UAP基因的数量并不相同，在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、埃及伊蚊Aedesaegypti和家蚕Bombyxmori中仅存在1个UAP基因序列(Schimmelpfengetal., 2006; Palakaetal., 2014)，而在赤拟谷盗Triboliumcastaneum、东亚飞蝗Locustamigratoria及马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata中发现了两个UAP基因序列(Arakaneetal., 2011; Liuetal., 2013; 史继峰, 2016)。以赤拟谷盗的TcUAP1和TcUAP2为靶基因进行RNA干扰，沉默TcUAP1导致幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹羽化的特异性阻滞，而TcUAP2的RNAi阻碍幼虫生长(Arakaneetal., 2011)。陈洁等(2014)向甜菜夜蛾Spodopteraexigua5龄幼虫注射dsSeUAP，发现蛹在头部形成上有障碍，或者幼虫-蛹的生长发育受阻，导致甜菜夜蛾几丁质合酶B基因表达明显下调。在东亚飞蝗2龄和5龄若虫中注射LmUAP1 dsRNA之后2 d的死亡率为100%，而当注射LmUAP2 dsRNA时则能够正常发育并成功地蜕皮进入下一阶段，推测LmUAP1的RNAi致死是由于表皮和中肠几丁质生物合成减少所致，而LmUAP2至少在若虫期不是东亚飞蝗发育所必需的(Liuetal., 2013)。果蝇的DmUAP基因突变体存在许多缺陷，主要是角质层和气管形态的缺陷，导致缺陷的原因主要是几丁质含量的减少(Arakaneetal., 2005; Schimmelpfengetal., 2006)。

暗黑鳃金龟Holotrichiaparallela属鞘翅目(Coleoptera)鳃金龟科(Melolonthidae)，幼虫称为蛴螬，是国内外公认的难防治的土栖性害虫，具有生活环境复杂和生活周期长等特点，目前对蛴螬的防治主要依靠化学防治，但农药的长期使用破坏了生态环境和作物品质，并导致蛴螬产生一定程度的抗药性，需要运用生物学技术手段开发环保、可持续的新型药剂，因此寻找有效的生物防治靶标和新型技术成为研究热点(Gengetal., 2019; Zhaoetal., 2021)。本研究前期通过分析暗黑鳃金龟幼虫转录组数据获得该虫几丁质合成代谢的关键基因HpUAP的cDNA序列，关于其在暗黑鳃金龟幼虫中的生理功能目前尚不明确。本研究拟通过克隆与表达HpUAP基因，分析其发育阶段和组织表达模式，利用RNAi技术沉默HpUAP基因，研究其对几丁质合成及幼虫生长发育的影响，明确HpUAP基因的生理功能，从而为暗黑鳃金龟生物防治提供新靶标。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

暗黑鳃金龟成虫于出土始盛期采集自河北省保定市军校广场周边林木，于河北农业大学植物保护学院生物化学与分子生物学实验室进行室内饲养。成虫使用新鲜榆树叶片饲养，卵表面消毒后于24孔板孵化，幼虫于光照培养箱中用玉米秸秆粉和甘蔗秸秆粉配制的饲料进行饲养，温度为26±1℃，相对湿度为60%～70%，光周期为12L∶12D。

1.2 供试菌株与载体

大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞购于TaKaRa公司，大肠杆菌BL21(DE3)和pET30a质粒由本实验室保存。

1.3 供试试剂

PrimeSTAR Max DNA Polymerase，BamHⅠ和SalⅠ购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific公司；动物组织总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒均购自TIANGEN公司；T7 RiboMAXTMExpress RNAi System购自Promega公司；SYBR Premix Ex TaqTM和1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自TaKaRa公司。LB液体和固体培养基，SOC液体培养基。

1.4 RNA的提取与cDNA的合成

参照RNAprep Pure Tissue Kit动物组织总RNA提取试剂盒说明书(TIANGEN，北京)，提取1-3龄第1, 5, 10, 15 和20天幼虫及3龄第2天幼虫的不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)的总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(Eppendorf，美国)检测RNA的质量和浓度。利用1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA。

1.5 HpUAP全长基因PCR扩增

通过暗黑鳃金龟幼虫转录组数据分析获得HpUAP基因的cDNA序列，运用DNAMAN V6.0软件设计HpUAP基因特异性引物，添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点(表1)。以暗黑鳃金龟幼虫体壁cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系: cDNA 1.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 2×PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL, ddH2O 10.5 μL。PCR扩增程序: 95℃预变性3 min; 95℃变性45 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸90 s, 5个循环; 95℃变性45 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸90 s, 5个循环; 95℃变性45 s, 56℃退火45 s, 72℃延伸90 s, 25个循环；72℃延伸10 min。使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.6 HpUAP序列分析

通过DNAMAN V6.0软件预测开放阅读框、编码的氨基酸、蛋白分子量和等电点等；通过SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在线软件进行蛋白结构域预测；利用ClustalX和MEGA X软件，采用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树。

1.7 HpUAP的原核表达

1.5节HpUAP的PCR扩增产物经测序分析结果正确后，将纯化后的PCR产物与pET30a载体分别使用BamHⅠ及SalⅠ双酶切，酶切产物纯化回收后使用T4 DNA连接酶进行连接，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，取适量菌液均匀的涂抹于含有卡那霉素(10 mg/mL)的固体LB培养基平板，于37℃培养箱倒置培养。次日随机挑取单菌落，经PCR和酶切验证正确后，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将重组表达质粒pET30a-HpUAP转入大肠杆菌 BL21感受态细胞，涂板培养挑取单菌落鉴定。将鉴定正确的菌株过夜培养， 次日转接后以220 r/min、37℃振荡培养至OD600=0.6，加入终浓度1 mmol/L IPTG于37℃诱导培养6 h，同时以未诱导菌液作为对照，经低温超声波破碎仪破碎菌体后低温离心，沉淀用含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液吹吸混匀，进行SDS-PAGE电泳及Western blot检测。

1.8 HpUAP表达模式分析

运用DNAMAN V6.0软件设计HpUAP基因特异性qRT-PCR引物QHpUAP-F1/QHpUAP-R1，以actin作为内参基因。引物信息见表1。引物由北京六合华大基因科技有限公司进行合成。以暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段和幼虫不同组织的cDNA为模板，进行qRT-PCR。PCR反应体系(20 μL): TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL, cDNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, 加ddH2O补足体系至20 μL。每种样品设3个生物学重复，每个生物学重复来自3头个体。在荧光实时定量PCR仪(CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System, BIO-RAD)上运行qRT-PCR程序，PCR程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 39个循环; 95℃ 1 min, 50℃ 1 min, 65～95℃，每5 s升温0.5℃，进行溶解曲线的扩增。每样品重复测定3次。

1.9 HpUAP的RNAi

以纯化的HpUAP的PCR产物和含GFP基因的质粒DNA为模板，利用RNAi引物(表1)进行PCR扩增，分别获得合成dsRNA所需正反向DNA模板。以纯化后的DNA产物为模板，利用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒制备dsRNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测dsRNA质量和浓度，置于-80℃冰箱保存备用。

取暗黑鳃金龟2龄第2天幼虫于第2和第3对足的交界处注射dsHpUAP和dsGFP(对照)，每头试虫注射5 μg dsRNA，共设置3个生物学重复，每个生物学重复10头幼虫，共计30头。注射完毕后，置于24孔板中以人工饲料饲育，每24 h观察幼虫表型变化，并记录死亡虫口数，72 h计算幼虫死亡率。收集试验组和对照组暗黑鳃金龟幼虫进行RNA的提取及cDNA的合成。qRT-PCR方法分析基因相对表达量，方法同1.8节。

1.10 HpUAP沉默对体壁中几丁质含量的影响

选取1.9节注射dsHpUAP和dsGFP72 h后的2龄幼虫进行几丁质含量检测(Zhang and Zhu, 2006; 李大琪, 2016)，具体方法如下：取暗黑鳃金龟幼虫整虫，于90℃烘箱中烘干至恒重，加入500 μL灭菌水，充分匀浆后离心取上清液；依次加入SDS和KOH进行消化，离心后弃上清；加入Celite 545悬浮液后，离心后弃上清，灭菌水清洗；分别加入NaNO2, KHSO4, NH4SO3NH2和MBTH溶液以及FeCl3·6H2O使其充分反应；吸取反应液至酶标板中，室温下放置25 min后，在650 nm处读取其吸光度值。利用氨基葡萄糖制作标准曲线。几丁质含量计算公式：几丁质(mg)/组织重量(g)=氨基葡萄糖浓度(μg/mL)/组织重量(g)。

1.11 数据分析

采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量(Livak and Schmittgen, 2001)，并利用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析方法进行不同发育时期和不同组织表达量差异显著性分析(ANOVA，LSD，P<0.05)，采用Student氏t检验方法分析RNAi沉默效率和几丁质含量数据的差异显著性。

2 结果

2.1 HpUAP基因克隆和序列特征

PCR扩增获得HpUAP基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788)，其开放阅读框序列长1 461 bp，编码486个氨基酸，预测蛋白分子量约为53.9 kD。

将HpUAP与其他5种鞘翅目昆虫UAP氨基酸序列比对，发现其与角胫叶甲GonioctenaquinquepunctataUAP氨基酸序列一致性最高，为69.20%(图1)。系统进化分析结果表明HpUAP与鞘翅目似牛嗡蜣螂Onthophagustaurinus的UAP以较高置信度聚为一个分支(图2)。

图1 5种鞘翅目昆虫UAPs的多重序列比对Fig. 1 Multiple sequence alignment of UAPs from five coleopteran species蛋白来源物种和GenBank登录号Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: HpUAP: 暗黑鳃金龟Holotrichia parallela, MW676788; GqUAP: 角胫叶甲Gonioctena quinquepunctata, KAG5869686.1; AgUAP: 光肩星天牛Anoplophora glabripennis, XP_018578897.1; LdUAP: 马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata, XP_023022882.1; IlUAP: 叩甲虫Ignelater luminosus, KAF2884840.1. 黑色实线标注的为UDPGP结构域。The UDPGP domains are marked with black solid line.

2.2 重组HpUAP的原核表达

HpUAP基因与pET30a载体连接转化大肠杆菌BL21，提取重组质粒，经BamHⅠ与SalⅠ酶切验证，成功构建BL21(pET30a-HpUAP)重组菌株。重组菌BL21(pET30a-HpUAP)经IPTG诱导，结果显示，37℃ 1 mmol/L IPTG诱导6 h时，HpUAP基因在重组大肠杆菌BL21(pET30a-HpUAP)中表达53.9 kD蛋白，以6×His抗体为一抗，进行Western blot分析，结果与预测大小一致(图3: A, B)。

2.3 HpUAP基因在不同发育时期及组织中的表达

不同发育阶段的表达结果显示HpUAP在暗黑鳃金龟1龄第1天和3龄第1天幼虫中高表达(图4: A)；组织表达谱结果表明，HpUAP在暗黑鳃金龟3龄幼虫中肠中表达量较高，其次是在体壁中(图4: B)。

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的不同昆虫UAPs的系统进化树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree of UAPs from different insectsconstructed by neighbor-joining method based onamino acid sequences (1 000 replicates)蛋白来源物种和GenBank登录号Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: DsUAP: 斑翅果蝇Drosophila suzukii, XP_016945538.1; DaUAP: 银额果蝇Drosophila albomicans, XP_034099583.1; CcUAP: 地中海实蝇Ceratitis capitata, XP_004519304.1; RpUAP: 苹果实蝇Rhagoletis pomonella, XP_036321443.1; BtUAP: 昆士兰果蝇Bactrocera tryoni, XP_039950810.1; BlUAP: 锈腹实蝇 Bactrocera latifrons, XP_018802042.1; BcUAP: 韭菜迟眼蕈蚊Bradysia coprophila, XP_037027705.1; CfUAP: 猫蚤Ctenocephalides felis, XP_026472332.1; BmUAP: 家蚕Bombyx mori, NP_001296486.1; VtUAP: 夏威夷红蛱蝶Vanessa tameamea, XP_026500069.1; BaUAP: 偏瞳蔽眼蝶 Bicyclus anynana, XP_023949028.1; HpUAP: 暗黑鳃金龟Holotrichia parallela, MW676788; OtUAP: 似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus, XP_022902179.1; FoUAP: 西花蓟马Frankliniella occidentalis, XP_026287145.1; CsUAP: 乾木白蚁Cryptotermes secundus, XP_023719032.1; LmUAP: 东亚飞蝗Locusta migratoria, AGN56418.1; AgUAP: 棉蚜Aphis gossypii, XP_027837611.1; MpUAP: 桃蚜Myzus persicae, XP_022183731.1; NlUAP: 褐飞虱Nilaparvata lugens, XP_022189563.1; SfUAP: 白背飞虱Sogatella furcifera, AQS60688.1; ClUAP: 温带臭虫 Cimex lectularius, XP_014239928.1; HhUAP: 茶翅蝽Halyomorpha halys, XP_014289230.1. 标尺示遗传距离。The scale bar indicates the genetic distance.

图3 重组质粒pET30a-HpUAP在大肠杆菌BL21中的表达产物的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)检测Fig. 3 Expression product of the recombinant plasmidpET30a-HpUAP in Escherichia coli BL21 detectedby SDS-PAGE (A) and Western blot (B)M: 蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker; 1: 未经IPTG诱导Not induced by IPTG; 2: IPTG诱导6 h Induced by IPTG for 6 h.

2.4 HpUAP的RNAi

注射dsHpUAP72 h后，与注射dsGFP的对照相比，暗黑鳃金龟2龄幼虫HpUAP的相对表达量降低了93.06%(P<0.001)(图5: A)。对照组幼虫可正常生长，注射dsHpUAP72 h后幼虫表现为生长缓慢，表皮颜色加深并皱缩，行动迟缓，在体表还出现不规则的黑色硬化物(图6);幼虫死亡率为56.67%,较对照组增加了40%左右(图5: B)。

暗黑鳃金龟2龄幼虫注射dsRNA 72 h后，体壁几丁质含量与对照组相比降低了29%(P<0.05)(图7)。

3 结论与讨论

本研究首次克隆鉴定了暗黑鳃金龟幼虫HpUAP(GenBank登录号: MW676788)，其开放阅读框长1 461 bp，编码氨基酸486个，预测蛋白分子量大小约为53.9 kD。NCBI Blast结果表明，HpUAP氨基酸序列与角胫叶甲UAP的一致性最高，为69.20%；其次是与叩甲虫UAP的，为67.37%(图1)。组织表达模式分析结果显示，HpUAP基因在3龄暗黑鳃金龟幼虫中肠和体壁中表达量较高(图4: B)。在甜菜夜蛾中UAP在体壁、卵巢中大量表达，在马氏管中少量表达，而在脂肪体中几乎检测不到UAP的表达(陈洁等, 2014)。马铃薯甲虫中UAP1在气管中表达量最高，其次在前肠、后肠、马氏管、体壁中表达;UAP2主要在中肠中高表达，在其他组织中表达量都很低(史继峰, 2016)。可以看出，不同昆虫UAP基因在不同组织中表达量不同，但均与几丁质的合成有关，说明UAP基因在昆虫几丁质的代谢通路中可能具有重要作用。发育时期表达模式分析结果显示，HpUAP在整个发育时期均有表达，在1龄第1天和3龄第1天幼虫中的表达量较高(图4: A)，推测由于幼虫孵育时需要快速合成大量几丁质用于幼虫的快速生长，该结果也与UAP在甜菜夜蛾中的表达模式(陈洁等, 2014)相似。

图4 HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(A)和3龄幼虫不同组织(B)中的表达谱Fig. 4 Expression profiles of HpUAP in different larval stages (A) and tissues of the 3rd instar larvae (B) of Holotrichia parallelaL1D1-L1D15: 分别为1龄第1-15天的幼虫Day-1-15 1st instar larvae, respectively; L2D1-L2D20: 分别为2龄第1-20天的幼虫 Day-1-20 2nd instar larvae, respectively; L3D1: 3龄第1天的幼虫 Day-1 3rd instar larva; IN: 体壁Integument; MT: 马氏管Malpighian tubules; FB: 脂肪体Fat body; IL: 回肠Ileum; RE: 直肠Rectum; MG: 中肠Midgut. 图中数据为平均值±标准误(n=3)；柱上不同字母表示基因表达量在不同发育阶段和组织间差异显著(P<0.05, LSD). Data in the figure are mean±SE (n=3). Different letters above bars represent significant differences in the gene expression level among different developmental stages and tissues (P<0.05, LSD).

图5 注射dsHpUAP 后暗黑鳃金龟2龄幼虫HpUAP的表达量(A)及死亡率(B)Fig. 5 Expression level of HpUAP (A) and mortality (B) of the 2nd instar larvae of Holotrichia parallelaafter injection of dsHpUAP 注射dsRNA 72 h后测定基因表达量。图中数据为平均值±标准误(n=3)；柱上三星号表示与对照组(CK)差异极显著(P<0.001, Student氏t检验)。Gene expression level was detected at 72 h after injection of dsRNA. Data in the figure are mean±SE (n=3). Triple asterisk above bars indicates extremely significant difference from the control group (CK)(P<0.001, Student’s t-test).

图6 注射dsHpUAP 72 h后暗黑鳃金龟2龄幼虫表型变化Fig. 6 Phenotypic changes of the 2nd instar larvae of Holotrichia parallela after injection of dsHpUAP for 72 h

图7 注射dsHpUAP 72 h后暗黑鳃金龟2龄幼虫体壁几丁质含量Fig. 7 Chitin content in the integument of the 2nd instarlarvae of Holotrichia parallela after injection of dsHpUAP for 72 h图中数据为平均值±标准误(n=3)；柱上星号表示与对照组(dsGFP注射组)差异显著(P<0.05, Student氏t检验)。Data in the figure are mean±SE(n=3). Asterisk above bar indicates significant difference from the control group (dsGFP injection group)(P<0.05, Student’s t-test).

在赤拟谷盗、飞蝗及马铃薯甲虫等昆虫中研究报道发现，UAP基因发生分化(Arakaneetal., 2011; Liuetal., 2013; 史继峰, 2016)，其中赤拟谷盗TcUAP1和TcUAP2分别在蜕皮期和蜕皮间期发挥作用(Arakaneetal., 2011)。马铃薯甲虫LdUAP1会使表皮甚至整虫中的几丁质含量显著降低，而LdUAP2会导致中肠围食膜中几丁质含量降低(史继峰, 2016)。在东亚飞蝗LmUAP1影响昆虫的正常发育，而LmUAP2在若虫期不是蝗虫发育所必需(Liuetal., 2013)。本研究利用RNAi技术验证HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫中的作用，选取2龄幼虫注射5 μg dsHpUAP，HpUAP基因的表达受到抑制(图5: A)，虫体颜色加深，动作迟缓，表皮皱缩(图6)，并且导致暗黑鳃金龟幼虫的死亡率增加(图5: B)。注射dsHpUAP后，几丁质含量降低了29%(图7)，推测由于UAP基因表达水平下降导致几丁质的前体物质UDP-GlcNAc合成不足，使几丁质合成受阻。研究结果说明，HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫生长发育中起重要作用。综上所述，本研究结果为进一步探讨暗黑鳃金龟幼虫UAP基因在几丁质代谢中的生理功能提供了科学参考，也为暗黑鳃金龟幼虫生物防治提供了新思路。