LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

王 博, 李苗苗, 王景娅, 胡晓玥, 阚云超, 乔惠丽

(南阳师范学院生命科学与农业工程学院, 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室, 河南南阳 473061)

长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸、不参与或很少参与编码蛋白质的内源性RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ转录生成。最初被认为是基因表达产物中的“转录噪音”。近年越来越多针对lncRNAs的功能研究表明，lncRNAs行使信号分子、诱饵分子、引导分子和支架分子的功能(Guptaetal., 2010; Kinoetal., 2010; Tsaietal., 2010; Matharu and Ahituv, 2015)。与mRNAs相比，lncRNAs主要存在于细胞核中，表达量比mRNAs低，保守性较低，具有时空表达特异性；与其他非编码RNA相比，lncRNAs具有数量多、种类多和作用方式多等特点。近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，越来越多的lncRNAs被发现，在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中发现了2 602个lncRNAs(Youngetal., 2012; Lopez-Ezquerraetal., 2017)，在拟南芥Arabidopsisthaliana中发现了2 708个lncRNAs(Liuetal., 2012)，在玉米Zeamays中预测了20 163个lncRNAs(Lietal., 2014)。目前，有关lncRNAs的功能和作用机制研究取得了许多突破性的进展，越来越多的研究表明lncRNAs主要从转录、转录后和表观遗传3个层面进行基因表达的调控，广泛参与不同生物的多种生命活动过程(Geisleretal., 2013; Kornienkoetal., 2013; Dykes and Emanueli, 2017; Statelloetal., 2021)。

LncRNAs在昆虫中的研究起步较晚，近几年不同昆虫物种中的lncRNAs相继被鉴定(Youngetal., 2012; Etebarietal., 2015, 2016; Jayakodietal., 2015; Jenkinsetal., 2015; Nyberg and Machado, 2016)。Wu等(2016)在家蚕Bombyxmori基因组中挖掘出共11 810个lncRNAs，其中内含子区lncRNAs 474个，基因间区lncRNAs 6 250个，反义lncRNAs 5 086个。Zhou等(2016)通过建立严格的lncRNAs筛选流程，进一步筛选出6 821个lncRNAs，并建立了家蚕的ncRNA数据库BmncRNAdb。LncRNAs在家蚕的丝腺发育、抗病毒和基因可变剪接中的功能研究也取得了一些进展(Zhouetal., 2018; Wangetal., 2019; Zhangetal., 2020)，研究发现反义lncRNA在家蚕性别决定基因dsx的可变剪接中发挥功能(Xuetal., 2019)。但由于lncRNAs具有数量多、种类多、作用方式多和保守性低等特点，昆虫中很多lncRNAs的功能和调控机制还不清楚。

昆虫的发育调控在农业害虫防治和经济昆虫品种改良中具有十分重要的作用。已知昆虫的变态发育过程受蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)和保幼激素(juvenile hormone, JH)的协同调控(Truman, 2019)。昆虫的脂肪体是参与能量代谢的主要组织，不仅提供昆虫不同发育阶段的能量需求，同时在幼虫到蛹的变态发育过程中经历复杂的器官重建过程，20E调控脂肪体的细胞自噬和凋亡在昆虫变态发育过程中发挥重要作用(Ihry and Bashirullah, 2014; Huetal., 2016; Lietal., 2020)。在果蝇中，研究人员发现20E可使中肠和脂肪体组织中与能量代谢相关的基因表达下调，从而抑制其代谢活性并起始变态(Whiteetal., 1999; Becksteadetal., 2005)。同样，在家蚕幼虫蜕皮和化蛹过程中，20E可抑制脂肪体中糖酵解相关基因的表达(Tianetal., 2010)。进一步研究表明，家蚕变态期中肠和丝腺细胞中自噬和凋亡的发生与体内20E滴度水平的变化相关，同时20E和饥饿处理可诱导家蚕幼虫脂肪体细胞自噬和凋亡的发生(Mizoguchietal., 2002; Tianetal., 2013; Xieetal., 2016)。但lncRNAs是否参与20E诱导的家蚕变态发育过程还未见报道。

本课题组在前期工作中通过构建家蚕脂肪体的12个转录组数据库，鉴定出1 035个lncRNAs，166个显著差异表达的lncRNAs与20E的响应有关，其中lncRNA63在20E处理家蚕5龄幼虫后2和6 h都显著上调。通过生物信息学预测发现lncRNA63的一个共表达基因为响应20E调控的家蚕激素受体3(hormone receptor 3, Hr3)基因(Qiaoetal., 2021)，且该基因在家蚕中有13个可变剪接体。为进一步鉴定lncRNA63与Hr3的共表达关系，阐明lncRNA63在家蚕变态发育调控中功能，本研究利用qRT-PCR检测lncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕不同发育阶段、幼虫不同组织和20E处理后不同时间幼虫脂肪体中的表达特征，采用细胞原位杂交确定lncRNA63在家蚕细胞中的定位，通过在家蚕个体中注射dsRNA干涉lncRNA63的表达，检测其共表达基因Hr3的表达变化，以期为后续深入研究lncRNA63在家蚕变态发育中的功能和调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

实验所用的家蚕品系为大造P50，孵化的家蚕幼虫于温度25℃，相对湿度60%～70%，光周期12L∶12D的条件下用新鲜桑叶饲养。实验所用细胞系为家蚕卵巢细胞系BmN，用含有10%胎牛血清的TC-100培养基中于28℃的细胞培养箱中培养。

RNA提取试剂Trizol Reagent(Invitrogen，美国)，反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermofisher，美国)，qRT-PCR试剂FastStart通用型SYBR®Green预混液(Roche, 瑞士)。用于细胞培养的试剂有TC-100昆虫培养基(BBI,上海)，胎牛血清(Gibco, 美国)，原位杂交试剂盒FluorescentInSituHybridization Kit(Ribo, 广州)，核质分离试剂盒Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit(Norgen，加拿大)。dsRNA体外转录合成试剂盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒(Promega，美国)。

1.2 家蚕lncRNA63的扩增和序列验证

基于课题组前期构建的家蚕脂肪体转录组数据库，鉴定到lncRNA63在20E处理家蚕5龄幼虫后2和6 h都显著上调，生物信息学预测其共表达基因为Hr3(Qiaoetal., 2021)。序列比对分析发现，lncRNA63所在的基因组可转录出2条RNA分子：ncRNA(GenBank登录号: XR_001139768)，与lncRNA63的序列相同；mRNA(GenBank登录号: AK406308),序列中间比lncRNA63多1 776 nt。因此我们首先设计了lncRNA63的全长扩增引物(表1)，同时该引物也能与上述两种不同RNA分子特异结合。家蚕Hr3具有13个可变剪接体，根据Hr3不同剪接体的序列特征，设计并合成了3对用于qRT-PCR检测的引物(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

利用Trizol试剂对家蚕脂肪体样品进行总RNA提取，利用超微量核酸蛋白测定仪对总RNA的浓度进行测定。每个样品取2 μg总RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA第1链，以此为模板对lncRNA63进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Premix ExTaq (TaKaRa) 10 μL, DNase/RNase-Free Water 8 μL。PCR反应程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min或3 min, 30个循环; 72℃延伸10 min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时对目的条带进行切胶回收，纯化后的产物连接T载，筛选阳性克隆进行测序分析。

1.3 家蚕lncRNA63及其共表达基因Hr3的时空表达分析

从家蚕幼虫4龄第2天至成虫第3天每天固定时间整虫取样， 4龄第 2-4 天和 5 龄第 1-8 天的幼虫解剖除去中肠内容物，化蛹后1-9 d，成虫羽化后1-3 d，每个样品3组，每组3头个体。选取家蚕5龄第3天幼虫进行解剖， 获得头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢9种组织，液氮速冻，每个样品3组，每组来自5头个体。同1.2节的方法提取家蚕不同样品的总RNA，反转录合成cDNA第1链，以家蚕actinA3(GenBank登录号: U49854)为内参基因，用FastStart通用型SYBR®Green预混液进行qRT-PCR检测。PCR反应体系(10 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, FastStart通用型SYBR预混液5 μL, DNase/RNase-Free Water 3 μL。PCR反应程序: 95℃ 15 s; 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40次循环；溶解曲线范围为65℃～95℃。

1.4 LncRNA63及其共表达基因Hr3在20E处理后家蚕脂肪体中的表达检测

选取家蚕5龄第2天幼虫，利用显微注射仪注射20E(2 μg/μL)于血淋巴，每头家蚕注射5 μg，对照组注射等体积的无水乙醇，注射后2, 6, 12和24 h后进行解剖，分别取处理和对照的脂肪体组织速冻于液氮，每个样品3组，每组来自5头个体。RNA提取和cDNA第1链合成同1.2节，qRT-PCR检测同1.3节。

1.5 LncRNA63在家蚕细胞中的表达检测

家蚕BmN细胞用含有10%胎牛血清的TC-100培养基中于28℃的细胞培养箱中培养，收集单层铺满的6孔细胞培养皿中的细胞，使用Cytoplasmic & Nuclear RNA Purification Kit分离并提取细胞核和细胞质RNA并进行反转录合成cDNA第1链(同1.2节)，qRT-PCR检测lncRNA63在家蚕BmN细胞的细胞质和细胞核中的相对表达量(同1.3节)。

1.6 LncRNA63的亚细胞定位

根据lncRNA63和家蚕U6(GenBank登录号: AY649381.1)的序列由锐博生物设计合成原位杂交特异杂交探针。将1.5节培养的状态良好的BmN细胞铺于24孔细胞培养皿的细胞爬片上过夜培养，然后将未经20E处理BmN细胞(对照)和每孔中添加20E(2 μg/μL)至终浓度为10 μmol/L处理2, 6, 12和24 h的BmN细胞用锐博的原位杂交探针试剂盒进行lncRNA63和内参U6的杂交。首先弃去细胞培养皿中的培养基，PBS清洗细胞5 min，共3次，用4%的多聚甲醛室温固定20 min；PBS清洗细胞，每孔加入300 μL预冷的通透液，4℃通透10 min；PBS清洗细胞，每孔加入200 μL预杂交液，在37℃封闭30 min；弃去预杂交液，避光条件下将2.5 μL浓度为20 μmol/L lncRNA63探针或2.5 μL浓度为20 μmol/L内参U6探针加入到150 μL杂交液中，37℃杂交过夜；然后用杂交洗液进行梯度洗脱，除去多余的探针。最后加入DAPI染液，室温孵育15 min，PBS清洗细胞5 min，共3次。将细胞爬片取出置于已滴加抗荧光淬灭封片剂的玻片上，用尼康Eclipse C1激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.7 LncRNA63的个体干涉

根据lncRNA63和对照GFP的基因序列设计并合成带有T7启动子的特异引物(表1)，以已构建的含有lncRNA63和GFP全长基因的T载质粒为模板，通过PCR扩增获得带有T7启动子的DNA模板。PCR反应体系(20 μL): 无菌水8 μL, 2×Ex Taq Mix(TaKaRa, 大连)10 μL, 质粒DNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。PCR反应程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃延伸10 min。扩增产物经纯化后利用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System体外转录合成lncRNA63和GFP的dsRNA。

选取家蚕5龄第2天幼虫，用显微注射仪将lncRNA63和对照GFP的dsRNA分别注射于幼虫血淋巴中，每头家蚕注射量为10 μg。注射后24 h分别取实验组和对照组的家蚕头、丝腺、体壁和脂肪体组织，每个样品3组，每组来自5头个体。利用同1.2节中的方法进行RNA提取和反转录合成cDNA第1链，qRT-PCR检测lncRNA63及其共表达基因Hr3在利用dsRNA干涉前后家蚕幼虫不同组织中的表达量变化(同1.3节)。

1.8 数据分析

qRT-PCR扩增结果采用2-ΔΔCt计算方法进行基因相对表达量分析。所有数据利用Prism8.0软件进行作图，并采用双尾非配对t检验分析比较各组实验数据间的差异显著性。

2 结果

2.1 家蚕lncRNA63及其共表达基因Hr3的时空表达

如图1所示，在4和5龄初期，lncRNA63的表达水平较低，在5龄中期开始上升，在5龄后期和整个蛹期保持了一个相对较高的表达水平，其中蛹期第4天有一个表达高峰，随后在蛹末期羽化前又出现一个表达高峰，化蛾后逐步下降。共表达基因Hr3的表达具有非常明显的阶段特异性，在4龄末到5龄的蜕皮期间出现一个表达高峰，在5龄第1天蜕皮完成后又迅速降低，在蛹末期羽化前再次出现一个表达高峰，羽化后表达量再次降低。由此可见，lncRNA63和Hr3家蚕不同发育阶段的表达特征不完全一致，但二者在羽化前的蛹末期都具有较高的表达。

图1 qRT-PCR检测家蚕lncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕不同发育阶段的表达量Fig. 1 Expression levels of lncRNA63 and its co-expression gene Hr3 in Bombyx mori at different developmental stages by qRT-PCR4L2d-5L8d: 分别为4龄第2-4天至5龄第1-8天幼虫Day-2-4 4th to day-1-8 5th instar larva, respectively; PP1-PP9: 分别为1-9日龄蛹 1-9-day-old pupa, respectively; A1-A3: 分别为羽化后1-3 d的成虫1-3-day-old adult, respectively. 图中数据为平均值±标准误。Data in the figure are mean±SE. 下同The same below.

如图2(A)所示，lncRNA63在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中表达量较高，在血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、精巢和卵巢中表达量较低。如图2(B)所示，Hr3在头、体壁、血淋巴、丝腺和卵巢中表达量较高，在中肠、马氏管、脂肪体以及精巢中表达量较低。由此可见，lncRNA63和Hr3在家蚕幼虫不同组织中呈现表达特异性，但二者在头、体壁和丝腺中都有较高表达。

图2 qRT-PCR检测家蚕lncRNA63(A)及其共表达基因Hr3 (B)在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达量Fig. 2 Expression levels of lncRNA63 (A) and its co-expressed gene Hr3 (B) in different tissues of the 5th instar larvae of Bombyx mori detected by qRT-PCR

图3 qRT-PCR检测lncRNA63(A)及其共表达基因Hr3 (B)在2 μg/μL 20E处理家蚕5龄第2天幼虫不同时间脂肪体中的表达量Fig. 3 Expression levels of lncRNA63 (A) and its co-expression gene Hr3 (B) in the fat body of the day-2 5thinstar larvae of Bombyx mori after treatment with 2 μg/μL 20E for different time detected by qRT-PCRCK: 无水乙醇Ethanol. 图中数据为平均值±标准误；柱上符号表示差异显著性(*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05)(双尾非配对t检验)；图4和7同。 Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate the significance of difference (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; nsP>0.05) by two-tailed, unpaired t-test. The same for Figs. 4 and 7.

2.2 家蚕lncRNA63及Hr3在20E处理不同时间脂肪体中的表达

结果显示，lncRNA63在20E处理后2, 6和12 h的家蚕脂肪体中的表达量逐渐升高(图3: A)，且与对照组相比均显著上调(P<0.05)，而在处理后24 h其表达量下降到与对照相当水平(P>0.05)。如图3(B)所示，Hr3的表达趋势与lncRNA63一致，在20E处理后2, 6和12 h其表达量逐步上升，且显著高于对照组(P<0.05)，24 h表达量也急剧下降，但仍显著高于对照组(P<0.05)。

2.3 LncRNA63的亚细胞定位

qRT-PCR检测结果如图4所示，内参基因actinA3在BmN细胞的细胞质中的相对表达量显著高于在细胞核中的(P<0.01)，由此表明BmN细胞的核质分离的效果较好。LncRNA63在细胞质和细胞核中均有表达，但lncRNA63在细胞核中表达量显著高于在细胞质中的(P<0.001)。

图4 qRT-PCR检测lncRNA63在家蚕BmN细胞质和细胞核中的表达量Fig. 4 Expression levels of lncRNA63 in the cytoplasm and nucleus of BmN cells of Bombyx mori by qRT-PCR

图5 原位杂交检测lncRNA63和U6在家蚕BmN细胞中的定位Fig. 5 Localization of lncRNA63 and U6 in Bombyx moriBmN cells detected by in situ hybridizationDAPI: DAPI染色显示细胞核Cell nucleus stained with DAPI; Cy3: 标记有Cy3的原位杂交探针在细胞中的分布情况Distribution of in situ hybridization probe labeled with Cy3 in the cell; Merge: DAPI和Cy3的叠加图像Overlay image of DAPI and Cy3. 激光共聚焦显微镜60倍。Confocal microscope with 60×magnification. 标尺Scale=20 μm. 图6同The same for Fig. 6.

LncRNA63的荧光原位杂交结果如图5所示，在对照家蚕BmN细胞中，lncRNA63与内参U6的细胞内定位相同，主要定位于细胞核，该结果与核质分离的qRT-PCR的检测结果(图4)也一致。lncRNA63在20E处理后不同时间BmN细胞中的核质定位情况如图6所示，在20E处理2 h后的BmN细胞中，lncRNA63在细胞质内的荧光信号明显增强；20E处理6 h后，lncRNA63在细胞质内的荧光减弱，细胞核内的荧光增强；在20E处理12和24 h后lncRNA63都主要定位于细胞核中，表明20E处理可引起lncRNA63的核质迁移。

2.4 RNAi干涉lncRNA63的效果

结果显示，与对照(dsGFP注射组)相比，在RNA干涉后家蚕5龄第3天幼虫的头、丝腺和脂肪体中lncRNA63都显著下调表达(P<0.01)，而在体壁中无显著变化(P>0.05)(图7: A)，Hr3与lncRNA63的表达模式一致，在lncRNA63被成功干涉后的头、丝腺和脂肪体中也都显著下调(P<0.01)，在体壁中无显著变化(P>0.05) (图7: B)。

图6 原位杂交检测lncRNA63在10 μmol/L 20E处理不同时间后家蚕BmN细胞中的定位Fig. 6 Localization of lncRNA63 in BmN cells of Bombyxmori treated with 10 μmol/L 20E for different timedetected by in situ hybridization

3 讨论

本研究通过对lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理后不同时间的幼虫脂肪体中表达分析，发现lncRNA63(图3: A)和Hr3(图3: B)在处理后2, 6, 12和24 h的表达都可以被20E激活且呈正相关，表达量变化趋势高度一致。通过在家蚕5龄幼虫个体中干涉lncRNA63的表达，发现在不同组织中Hr3的表达都显著降低(图7: B)，由此进一步表明Hr3是lncRNA63的共表达基因。作为受20E诱导的激素受体基因，研究发现Hr3不仅可在家蚕卵巢中的卵黄发生过程中发挥关键的调控作用(Eystathioyetal., 2001)，还可调控埃及伊蚊Aedesaegypti卵黄原蛋白基因的表达和终止(Mane-Padrosetal., 2012)。此外，研究人员还发现Hr3在20E调控的昆虫细胞自噬、蜕皮和变态发育过程中也具有重要功能(Tianetal., 2013; Guoetal., 2015; Zhaoetal., 2018)。LncRNA63和Hr3在家蚕的不同组织中和不同发育阶段的表达分析表明，二者在5龄幼虫不同组织中的表达特征既有特异性又有相似性，尤其是lncRNA63(图2: A)和Hr3(图2: B)在头、体壁和丝腺中都有较高表达；在4龄第2天幼虫到成虫不同发育阶段的表达分析中，lncRNA63和Hr3的表达趋势不完全相同，但二者在羽化前的蛹末期都有一个表达高峰(图1)。由于lncRNA63的表达具有组织特异性，推测lncRNA63和Hr3在不同发育阶段的表达差异可能与整虫取样有关。

图7 qRT-PCR检测RNA干涉24 h后家蚕5龄第3天幼虫不同组织中lncRNA63(A)和Hr3(B)的表达量Fig. 7 Expression levels of lncRNA63 (A) and Hr3 (B) in different tissues of the day-3 5th instar larvae of Bombyx mori after RNA interference for 24 h detected by qRT-PCR

由于lncRNAs在细胞质和细胞核中具有不同的功能和作用机制，为探索lncRNA63在家蚕变态发育中的功能，我们对lncRNA63在家蚕细胞中的亚细胞定位进行分析。qRT-PCR的检测结果(图4)与原位杂交(图5)的结果一致，lncRNA63在正常家蚕细胞中主要位于细胞核。据报道，lncRNAs大多由RNA聚合酶Ⅱ转录产生，由于其加工剪接效率较低，多呈现出明显的细胞核定位现象。细胞核lncRNAs可通过与DNA, RNA或蛋白质等分子相互作用，调控染色质的结构和功能；或者顺式或反式调节基因的转录，影响mRNA的剪接、稳定和翻译等。而剪接加工完全的lncRNA可通过与mRNA类似的机制转运到细胞之中，进而在转录后水平反式调控基因表达或参与细胞内信号通路的调控(Statelloetal., 2021)。由于lncRNA63在家蚕幼虫脂肪体中的表达受20E的调控，那么20E是否影响lncRNA63的核质定位变化？因此我们检测了lncRNA63在20E处理后不同时间BmN细胞中的核质定位情况。结果发现，20E处理早期可引起lncRNA63在细胞核和细胞质中的定位发生明显变化，随着处理时间的延长又恢复到其在对照细胞(图5)的定位(图6)。lncRNA的核质迁移在哺乳动物中已有报道，小鼠的lncRNA Neat1可通过从细胞核向细胞质的转移参与巨噬细胞的炎症激活(Zhangetal., 2019)，但在昆虫中目前还未见报道。在家蚕化蛹期间20E可通过Hr3上调自噬相关基因的表达并进而诱导脂肪体细胞自噬的发生(Tianetal., 2013)。在果蝇中，Hr3的表达与发育过程中20E的滴度相关，在3龄幼虫中表达量增加，而Hr3在果蝇中的延迟表达是幼虫向蛹转变所必需的(Ruaudetal., 2010)。此外，在蝗虫、烟草天蛾Manducasexta和棉铃虫中，Hr3的表达也受20E信号介导(Langelanetal., 2000; Zhaoetal., 2004, 2018)。LncRNA63的序列特征表明其经过转录后的剪接加工，且作为lncRNA63前体的AK406308具有polyA尾，推测lncRNA63可能通过类似mRNA的转运机制在20E处理后进入细胞质中调控Hr3基因的表达。

综上所述，本研究通过对家蚕中一个新的lncRNA及其共表达基因Hr3的表达分析、细胞定位和个体干涉研究，验证Hr3是lncRNA63的共表达基因；20E不仅可调控lncRNA63的表达，同时可诱导lncRNA63的核质迁移，推测lncRNA63可能通过共表达基因Hr3参与家蚕20E调控的脂肪体发育过程。但lncRNA63响应20E调控的分子机制及其在家蚕变态发育中的功能，还有待进一步深入研究。