桃红四物汤对糖尿病脑病大鼠认知功能的保护作用

章梦玲，蔡 明，4，夏文文，戴文涛，赵梦蝶，韩燕全，韩 岚，彭代银

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230012；3.中药复方重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；5.六安市中医院，安徽 六安 237000；6.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)

糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足，或周围组织产生胰岛素抵抗而引起的代谢紊乱的疾病，其特征之一在于血液中的高水平葡萄糖[1-2]。而体内长期持续性高血糖会造成人体的多种组织器官损害，包括足部、肾脏、骨骼等[3-5]。同时，长期暴露在高糖环境中会引起脑部氧化应激的产生，造成脑部神经细胞的死亡，从而对患者的认知功能造成影响，形成糖尿病脑病(diabetic encephalopathy，DE)[6]。糖尿病患者体内的胰岛素抵抗会导致β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)的聚集，加重神经毒性损伤大脑[7]。Aβ还可以通过增加氧化应激诱导神经细胞死亡，而氧化应激也会增加Aβ的产生，造成更多的氧化损伤，促进相关的神经细胞凋亡[8]。桃红四物汤来源于中医的传统名方，其中包含的成分可以透过血脑屏障在脑内发挥作用，减少神经细胞的凋亡[9]。值得注意的是，通过网络药理学的技术对桃红四物汤治疗疾病的KEGG富集分析发现，桃红四物汤对糖尿病相关通路有很好的调节作用[14]。这表明桃红四物汤、DE、Aβ和氧化应激之间有着潜在关联。本研究在前期研究基础上复制DE模型，观察桃红四物汤对DE的干预和治疗作用，及其对Aβ沉积和氧化应激的影响，进一步探讨桃红四物汤治疗DE的可能机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级7周龄雄性SD大鼠90只，体质量为240～260 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003]提供，所有动物实验过程均经安徽中医药大学动物管理与使用委员会批准，动物伦理编号：AHUCM-rats-2021056。大鼠饲养于20～26 ℃环境下，相对湿度为40%～70%，12 h/12 h昼夜交替，给予自由饮水和标准饲料，适应性饲养1周。

1.2 药物 桃红四物汤的制备：熟地黄、当归、白芍、川芎、桃仁、红花的质量比为4∶3∶3∶2∶3∶2，按比例称取6味药材后，加入药物总质量的10倍量的蒸馏水冷凝回流提取2 h，过滤并且保留滤液，滤渣加入药物开始总质量的8倍量的蒸馏水冷凝回流提取2 h后再过滤，将两次滤液合并，并且旋转蒸发浓缩成18 g/kg的浓缩液， -20 ℃保存备用。

1.3 试药 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，批号 EZ34148220，纯度> 98%)：德国Biofrxx；高糖高脂饲料(10%猪油、10%蔗糖、2.5%胆固醇、77.5%基础饲料)；二甲双胍(批号 ABS5837)：中美上海施贵宝；多奈哌齐(批号 2010014)：中国卫材；试剂盒三酰甘油(triglycerides，TG；批号 202007311)、总胆固醇(total cholesterol，TC；批号 202006511)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C；批号 202006211)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C；批号 202011271)：上海振科；淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP；批号 ab241592)、β-分泌酶(β-secretase，BACE；批号 ab183612)：英国Abcam；β-淀粉样蛋白1-40(amyloid-β 1-40,Aβ1-40；批号 D8Q7I)、Aβ1-42(批号 D9A3A)：美国Cell Signaling Technology；GAPDH(批号 R24404)：正宁生物；兔抗(批号 A21030)、鼠抗(批号 A25022)：美国Abbkine；过氧化脂质(lipid peroxide，LPO；批号 20210708)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS；批号 20210711)：南京建成；引物序列：Aβ1-40(上游引物：5′-TCGTGATTCCTTACCGGTGC-3′；下游引物：5′-TCGTGATTCCTTACCGGTGC-3′)，Aβ1-42(上游引物：5′-TGTGCTCGTCTTGCTCCTGACTA-3′；下游引物：5′-CTCAGCAGAGGCATCCATGTTC-3′)，BACE1(上游引物：5′-TTTCCCAGTCATTTCACTTTACCT-3′；下游引物：5′-ACTCATCTGTCTGTGGAATGTTGT-3′)，APP(上游引物：5′-CCCATCAGGGACCAAAACC-3′；下游引物：5′-GAAGGGCATCGCTTACAAACT-3′)。

1.4 仪器 自动脱水机(ZT-12M)、石蜡包埋机(YB-7B)：孝感亚光医用电子技术有限公司；包埋机(JB-P5)：武汉俊杰电子有限公司；病理切片机(RM2016)：上海徕卡仪器有限公司；组织切片机(KD-P)：金华市科迪仪器设备有限公司；烤箱(DGX-9003B)：上海福玛实验仪器有限公司；倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse TI-SR)、成像系统(Nikon DS-U3)：日本尼康；转膜仪(VE-186型)、电泳仪(EPS 300 型)、电泳槽(VE-180 型)：上海天能科技有限公司；超灵敏多功能成像仪(AMERSHAM IMAGER 600)：美国GE；全波长酶标仪：美国Thermofisher；荧光定量PCR仪(MX3000P)：美国Agilent。

2 方法

2.1 DE模型的建立 大鼠适应性饲养1周，随机分出10只作为对照组，给予普通基础饲料喂养；其余大鼠给予高糖高脂饲料喂养4周，并且记录体质量和血糖值，4周后采用STZ(35 mg/kg)一次性腹腔注射。3 d后对所有大鼠尾静脉采血测量随机血糖，如果血糖值高于16.7 mmol/L，则判定糖尿病大鼠模型建立成功。对成功建立糖尿病模型的大鼠继续监测5周的体质量和血糖情况，并且采用Morris水迷宫观察大鼠学习记忆能力，判定DE模型是否建立成功。

2.2 分组及治疗 选取成功建立DE模型的大鼠，随机分为模型组(蒸馏水)、桃红四物汤低剂量组(4.5 g/kg，相当于临床等效剂量1倍)、桃红四物汤中剂量组(9 g/kg)、桃红四物汤高剂量组(18 g/kg)、二甲双胍组(0.2 g/kg)、多奈哌齐组(1 mg/kg)，每组10只，每天灌胃给药1次；另取正常雄性大鼠10只作为对照组。期间所有大鼠均自由饮水与摄食，连续5周。

2.3 Morris水迷宫实验 连续4 d进行训练，分别从4个象限入水，引导大鼠学会寻找平台。第5天固定一个入水点，记录大鼠从入水到爬上平台花费的时间，即潜逃潜伏期。如果90 s内找不到平台，潜逃潜伏期记为90 s，并记录大鼠逃避路径。

2.4 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察大鼠海马组织神经细胞形态变化 取固定于4%多聚甲醛中的大鼠海马组织，每组3个样品组织放入脱水盒中编号，并用不同浓度的乙醇进行脱水处理，再用二甲苯进行透明以及浸蜡处理。再对组织进行包埋、切片和烘干。将烘干的组织切片脱蜡后采用不同浓度的乙醇水洗，采用HE进行染色和脱水，最后用中性树胶进行封片，晾干并观察。

2.5 大鼠脑组织匀浆和血清的生化分析 取大鼠脑组织匀浆进行生化分析，LPO含量和NOS活性采用LPO含量检测试剂盒(比色法)和NOS测定试剂盒(比色法)进行测定。取大鼠腹主动脉血清对血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C进行测定，所有步骤按照试剂盒说明书操作。

2.6 实时定量聚合酶链反应法检测大鼠脑组织APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表达水平 每组称取3只大鼠海马组织50～100 mg，液氮研磨后，采用TRIzol法提取组织总RNA。采用cDNA 试剂盒，进行反转录得到cDNA。最后取cDNA作为荧光定量的模板，进行荧光定量PCR反应，实验重复3次。以β-actin 作为内参，采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达水平。

3 结果

3.1 桃红四物汤对DE模型大鼠血糖与体质量的影响 在适应性饲养1周结束后，各组大鼠体质量持续增加，随机血糖值均小于6 mmol/L；模型复制2周后，模型组大鼠体质量开始持续减低，随机血糖大于16.7 mmol/L；与模型组比较，各给药组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)，桃红四物汤高剂量组及二甲双胍组大鼠血糖值明显下降(P<0.05)。见图1。

3.2 桃红四物汤对DE模型大鼠学习记忆能力的影响 对照组大鼠水迷宫逃避潜伏期时间较短；与对照组比较，模型组逃避潜伏期时间明显延长(P<0.05)；与模型组比较，桃红四物汤高、中剂量给药组和二甲双胍、多奈哌齐组大鼠的逃避潜伏期明显降低(P<0.05)。见图2。

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 桃红四物汤对DE模型大鼠血脂水平的影响 与对照组大鼠比较，模型组大鼠LDL-C、TG、TC的含量均显著升高(P<0.05)，HDL-C含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，桃红四物汤给药组与二甲双胍、多奈哌齐组LDL-C、TG、TC含量均显著下降(P<0.05)，HDL-C水平显著升高(P<0.05)。结果表明桃红四物汤对大鼠血脂水平具有一定的调控作用。见图3。

3.4 桃红四物汤对DE模型大鼠神经细胞的保护作用 对照组大鼠海马组织神经细胞排列整齐，密度较大，分布均匀，细胞轮廓清晰，同时细胞核圆润且明显。与对照组比较，模型组海马组织神经细胞数量显著减少，排列结构紊乱，细胞轮廓不清晰，形态异常。桃红四物汤的干预改善了这一情况，明显增加了正常神经细胞的数量，神经细胞的形态较正常，部分神经细胞的细胞核圆润且明显，结构较完整，排列相对有序。见图4。

3.5 桃红四物汤对DE模型大鼠氧化应激水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠脑组织LPO含量、NOS活力均显著增加(P<0.05)。与模型组比较，桃红四物汤各给药组大鼠LPO含量、NOS活力均显著降低(P<0.05)。结果表明，桃红四物汤能够明显改善DE模型大鼠体内氧化应激水平，从而对神经细胞发挥一定的保护作用。见图5。

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组；蓝色点为起点，红色点为终点；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.6 桃红四物汤对DE模型大鼠海马组织中Aβ沉积的作用 与对照组比较，模型组大鼠海马组织中APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表达水平显著上调(P<0.05)；与模型组比较，桃红四物汤各剂量组APP、BACE1、Aβ1-40、Aβ1-42mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。见图6。

注：A.正常组；B.模型组；C.桃红四物汤低剂量组；D.桃红四物汤中剂量组；E.桃红四物汤高剂量组；F.二甲双胍组；G.多奈哌齐组；注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

越来越多的证据表明，2型糖尿病患病率的急剧增加与肥胖、血脂等多种因素密切相关[11]。有研究[12]表明，长时间的高血糖状态会对大鼠的认知功能会造成损伤，发展为DE。

中医认为糖尿病的病机为气虚寒凝血瘀[13-14]，气虚则帅血无力，血液行缓；加之糖尿病患者喜食肥甘，糖脂积滞成浊，多挟痰浊。DE多属于本虚标实，其中气阴两虚为本、痰浊瘀阻为实[15]。现代西医常用二甲双胍治疗2型糖尿病，多奈哌齐抑制中枢乙酰胆碱酯酶治疗认知功能障碍，然而二者的治疗效果单一。因此，越来越多的学者对中医药治疗DE的效果展开研究[16]。桃红四物汤来源于《医宗金鉴》，现代药理学研究[17]发现，桃红四物汤通过调节神经营养因子的表达，对脑部神经细胞发挥保护作用。本实验研究结果表明，桃红四物汤能够显著改善DE模型大鼠的血糖和血脂水平。桃红四物汤可以降低DE模型大鼠的氧化应激反应，抑制APP和BACE1的表达，从而抑制Aβ的产生，发挥神经细胞的保护作用，改善DE模型大鼠的学习记忆能力。

DE模型大鼠往往伴有体内血脂水平的异常，血管的功能障碍与神经退行性病变的发展具有一定的协同作用，可以加重认知功能障碍[18]。此外，Aβ的沉积能够对大脑认知功能造成伤害，Aβ本身具有多种长度，其中Aβ1-40和Aβ1-42被认为是造成认知损害的关键物质[19]。Aβ是由APP水解在细胞内和内质网中产生，主要是由BACE1和γ-分泌酶切割而形成。γ-分泌酶的精确氨基酸切割位点对于阿尔茨海默病的发病机制至关重要，因为其决定了Aβ形式多肽产物的长度[20]。然而，BACE1是整个过程中的限速酶，其抑制APP和BACE1的表达从而抑制Aβ产生，这是治疗阿尔茨默病的关键靶点[21]。本实验研究发现，桃红四物汤能够抑制Aβ、APP和BACE1的表达，提示桃红四物汤可以通过抑制APP的水解反应，从而降低Aβ的表达水平，发挥神经保护作用。同时在本实验中，通过比较二甲双胍和多奈哌齐两种阳性药与桃红四物汤对DE的治疗效果，发现二甲双胍可以显著降低DE模型大鼠的血糖水平，然而水迷宫实验结果表明其对改善大鼠学习记忆能力效果不显著。多奈哌齐可以改善学习记忆能力却不能降低血糖。二者在改善DE模型大鼠血脂水平尤其是TG水平方面均无明显疗效。而桃红四物汤在降低血糖的同时，能够改善DE模型大鼠学习记忆能力、体内血脂以及氧化应激水平。

综上所述，本研究结果表明，桃红四物汤可能通过降低DE模型大鼠的血脂和氧化应激水平， 抑制Aβ生成的靶点APP和BACE1的表达，减少Aβ的沉积，保护神经细胞从而提高DE模型大鼠的学习记忆能力。