mNGS在1例儿童感染性疾病后期的临床应用及文献分析*

祁云霞 王 森 司艳凤 李树军 王志远

新乡医学院第一附属医院儿科，河南省卫辉市 453100

近年来宏基因组二代测序(mNGS)技术在儿童感染性疾病中的临床应用逐渐增多，成为病原学诊断的新方法，mNGS在疾病早期可快速明确病原，为临床及时、精准治疗提供有力证据[1]；本文介绍1例脓毒性休克患儿的诊疗经过，探讨mNGS检测在治疗后期的临床应用价值，并结合相关文献分析进行论述，以期为儿科医师提供相关经验。

1 病例资料

患儿女，3岁2个月，以“咳嗽6d，发热、皮疹1d，间断抽搐半天”为代主诉入住我院儿童重症监护室(PICU)。偶咳黄黏痰，1d前出现发热、皮疹，热峰39.8℃，热型不规则，伴有全身散在皮疹，以躯干部为著，呈暗红色出血性疱疹，凸出皮面，伴瘙痒；半天前突发抽搐，表现为意识丧失、双眼向上凝视、双手握拳、四肢僵直、面色青紫、口吐泡沫、持续约2min后缓解，缓解后入睡，当地医院头颅CT未见明显异常；3h前再次出现抽搐，表现同前，意识障碍进行性加重，出现昏迷，急诊入我院PICU。病程中无呼吸困难、腹痛、大小便失禁等表现。饮食差，睡眠多，大便偏稀，小便正常，体质量无变化。既往史、个人史、家族史未见异常。体格检查：体温37.7℃，脉搏161次/min，呼吸30次/min，体质量14kg，血压104/65mmHg(1mmHg=0.133kPa)，昏迷。全身较多红色皮疹，以头面部及躯干为著，呈圆形疱疹、斑丘疹及出血性皮疹，直径0.2～0.5cm不等，较大者可达3.0cm，家属诉有痒感、可见抓痕，凸出皮面，压之不褪色，见图1。颈抵抗，经口气管插管，心率增快。双肺呼吸音粗，未闻及啰音，腹部查体未见明显异常。毛细血管再充盈时间(CRT)6s、生理反射、病理反射未引出。Glasgow评分：刺激后无反应1分、无运动反应1分、无说话反应1分。患儿血压进行性下降至58/30mmHg，心率236次/min。辅助检查：血常规：白细胞28.2×109/L，红细胞4.54×1012/L，血红蛋白127g/L，血小板74×109/L，中性粒细胞比值89.5%，淋巴细胞比值7.8%；超敏C反应蛋白(CRP)370.7mg/L；免疫五项：补体C3 0.56g/L；降钙素原(PCT)>100ng/ml；白介素6(IL-6)887.2pg/ml；乳酸3.0mmol/L；快速血氨35μmol/L；肾功能：尿素8.87mmol/L、尿酸596μmol/L；肝功能：白蛋白29.1g/L、谷丙转氨酶130U/L、谷草转氨酶281U/L；心肌酶：乳酸脱氢酶2 652U/L、肌酸激酶10 435U/L、肌酸激酶同工酶活力243U/L；B型钠尿肽前体2 040pg/ml；凝血六项：凝血酶原时间22.7sec、凝血酶原活动度40%、活化部分凝血活酶时间71.9sec、纤维蛋白原425mg/dl、纤维蛋白降解产物151.1μg/ml、D二聚体59.6μg/ml；心脏彩超、胸部正位片未见明显异常；血清嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、2和3型IgM抗体均阴性；心肌酶标志物：肌红蛋白266.1ng/ml、肌钙蛋白I 0.215ng/ml、CK同工酶质量15.65ng/ml；血培养结果：唾液链球菌，药敏：阿莫西林、氯霉素、美罗培南、利耐唑胺、万古霉素敏感；腰椎穿刺：脑脊液压力>200mmH2O(1mmH2O=0.098kPa)；常规：无色、清亮、无凝集、潘氏试验阴性，有核细胞计数2×106/L；生化：氯122.8mmol/L、葡萄糖3.5mmol/L、腺苷脱氨酶1.3U/L、总蛋白193.7mg/L；头颅MRS+增强：左侧海马MRS考虑抽搐后改变；24h视频脑电图：正常睡眠脑电图。临床诊断：(1)脓毒性休克；(2)皮疹查因：病毒性皮疹？(3)重症病毒性脑炎。入院紧急给予扩容抗休克、血管活性药物应用、头孢曲松抗细菌、阿昔洛韦抗病毒、补充凝血因子、人免疫球蛋白应用、降颅压、呼吸机辅助呼吸、营养神经等治疗；单重血浆置换(Plasma exchange ，PE)1次，连续性血液透析滤过 (Continuous veno-venous hemodiafiltration，CVVHDF )治疗4d后患儿意识渐恢复正常，自主呼吸增强，逐步撤离呼吸机、停用血管活性药物。住院第8天，感染指标逐步恢复正常，但患儿皮疹仍未消退，皮肤科医师会诊考虑为脓疱疮，行皮损处皮肤活检，病理诊断：表皮角化过度，角质层与表皮松解，可见大疱形成，表皮下结缔组织增生伴玻璃样变性，可见灶性炎细胞浸润，见图2。皮肤病理无明确指向性，血培养唾液链球菌不能解释患儿皮疹情况。送检5ml血液行mNGS(DNA+RNA)检查，PathoSeqTM病原微生物宏基因组检测报告：人类疱疹病毒3型(序列数59、相对丰度100%)。停用抗菌药物，继续阿昔洛韦抗病毒及对症支持治疗，动态复查血常规、肝肾功能、电解质、心肌酶、炎症指标均未见明显异常，患儿神志恢复正常，精神好，未再抽搐，住院治疗18d，皮疹基本消退，痊愈出院。住院期间该患儿父亲感染水痘。最终诊断：(1)脓毒性休克；(2)出血性水痘；(3)重症病毒性脑炎；(4)呼吸衰竭；(5)多脏器损伤；(6)弥散性血管内凝血。

图1 患儿皮损情况

图2 患儿皮肤病理

2 讨论

该患儿病情危重且进展迅速，感染唾液链球菌后引起全身炎症反应综合征(SIRS)，并迅速出现呼吸衰竭、组织低灌注、凝血功能障碍、肝脏、心脏损伤；病情进展为脓毒性休克，伴血压进行性下降，为失代偿期，有进一步加重出现多器官功能障碍的趋势，符合儿科重症血液净化治疗的应用范畴[2]，及早治疗是改善预后、降低病死率的关键。在严重脓毒症患儿中进行血液净化治疗，CVVHDF是常用模式，主要清除中小分子物质，联合PE模式可清除致病的大分子物质，改善凝血功能。其机制在于调节致炎和抗炎介质浓度，下调炎性反应，阻断脓毒症的细胞因子风暴，阻止多器官功能衰竭的发生，改善机体血流动力学状态、减少正性肌力药物用量，提高存活率。

病原检测是感染性疾病诊断的重要环节，该患儿血培养结果并不能解释其全部临床表现，皮肤科医师的经验及皮肤活检结果并未给出明确病原指向。寻求一种更好的检测方法至关重要，高通量测序技术又称为二代测序(NGS)，可同时对大量核酸片段进行检测，将NGS应用于临床微生物检测的研究方法称为宏基因组二代测序[3]。mNGS直接从样本中获得病原体的核酸序列，再对获得的核酸序列进行对比分析，不仅可以检测已知病原体的基因组，还能从头组装未知微生物的基因组，对发现未知病原体感染有重要意义[4]。2019nCoV就是从2位成年患者的肺泡灌洗液中提取的核酸进行mNGS测序鉴定出来的[5]。

《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》的推荐意见：(1)怀疑血流感染，对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2ml血标本，分离血浆后保存于-16～20 ℃冰箱，血培养3d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。若未留标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。(2)对于临床疑似感染的危重患者，建议完善传统实验室及分资生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)[6]。共识推荐对于重症感染患者早期采取二代测序检测病原，推荐对血流感染的患者若血培养结果未报阳性结果且经验性治疗无效时也可进行二代测序，依据共识该患儿可行二代测序检测。

早期已经开始的抗感染治疗是否影响二代测序诊断性能，目前并无高质量的研究证据，血流感染进行mNGS的时间窗并未确定。有研究证实发病1～2周后二代测序的阳性率仍高于血培养，但会随着发病时间的延长，阳性率下降[7]。这也可解释血培养中出现唾液链球菌，但mNGS却未发现唾液链球菌，考虑与抗感染治疗后细菌清除有关。这也恰恰为停用抗菌药物、预防抗菌药物滥用提供了依据，明确指导了下一步的抗病毒治疗，本病例在治疗后期应用mNGS测序为精准治疗提供了有力支持。

关于mNGS检测出的人类疱疹病毒3型，又称为水痘—带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VzV)，是嗜神经及皮肤的疱疹病毒，基因组为双股DNA，感染儿童后多出现水痘，是一种具有高传染性的出疹性疾病，皮疹特征为：全身皮肤黏膜成批出疹，皮疹呈向心性分布，斑丘疹、丘疹、疱疹、结痂同时存在。少数体弱或应用免疫抑制剂治疗者会出现重症水痘，有出血性疱疹。患儿父亲出现水痘表现，进一步证实了该患儿感染VzV病原。

总之，mNGS对于儿童感染性疾病的病原体诊断灵敏性高、检测速度快，同时可以为某些病因未明病例提供更全面的病原检测方法，被推荐为症感染病例的早期检测手段，也作为常规检测阴性结果的补充检测。疾病后期的mNGS检测可能会为疾病的精准治疗提供有力证据。