电针激痛点对慢性肌筋膜疼痛综合征大鼠脊髓背角胶质细胞的影响*

王 列 马 帅 马铁明△ 马俊杰 胡 哲 林德龙

1辽宁中医药大学针灸推拿学院，沈阳 1108472辽宁省针灸养生康复重点实验室，沈阳 1108473沈阳市第七人民医院神经内科，沈阳 1100034 北京中医药大学第二临床医学院，北京 100105

肌筋膜激痛点(myofascial trigger points，MTrPs)为肌肉组织紧绷区域中异常的敏感小点[1]。在临床上，若MTrPs引发所在骨骼肌疼痛、抽搐反应以及远端牵涉痛等症状，可认为该MTrPs处于激活状态，由该MTrPs引发的系列症状称之为肌筋膜疼痛综合征(myofascial pain syndrome，MPS)[2]。当MTrPs处于激活状态一旦超过3个月，则使急性MPS转变成慢性MPS，此时患者不仅慢性疼痛症状明显，且易伴有焦虑、抑郁、睡眠障碍等问题。

目前，MTrPs形成机制尚不明确，但它是MPS发病的直接病因。临床多用肌松药或非甾体抗炎药来治疗MPS[2]，其可改善肌肉局部挛缩，缓解疼痛症状，但不能从根本上灭活MTrPs。针灸技术能打破MTrPs局部能量危机，改善微循环，降低炎症因子水平，是有效的MTrPs灭活措施[3]，但其作用机制的研究多停留在周围局部组织层面，尚缺乏脊髓及以上的机制研究。近年研究发现，脊髓背角中的星形胶质细胞和小胶质细胞在MTrPs活化与诱发牵涉痛及中枢敏化中起着重要作用[4]。本研究通过建立慢性MPS大鼠模型，观察电针激痛点治疗慢性MPS是否与调节脊髓背角星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小胶质细胞特异表达补体受体-3的单克隆抗体(OX-42)表达有关，以探讨电针治疗慢性MPS的可能机制，为今后的深入研究奠定生物学基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠24只(SPF级，7周龄，体质量220 g～250 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。大鼠在室温(25±1)℃、相对湿度(50%±3%)条件下自由摄食和饮水，适应性饲养1周。

1.2 实验试剂及仪器

兔抗鼠GFAP单克隆抗体(武汉华美生物工程有限公司)；兔抗鼠OX-42单克隆抗体(GeneTex公司)；PBS缓冲液、DAB显色剂素(北京博奥森生物技术有限公司)。

FT-200动物跑步机(成都泰盟软件有限公司)；BL-420 S生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)；电针仪(汕头医用设备厂有限公司)；华佗牌无菌针灸针0.35 mm×40 mm(苏州医疗用品厂有限公司)；徕卡全自动免疫组化及原位杂交染色机(德国Leica)；多功能酶标仪(德国伯托公司)；自制打击装置。

1.3 模型复制及分组

将24只健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针组，每组8只。采用黄强民团队[5]提出的钝性打击结合离心运动方式进行造模。每周先进行一次钝性打击，第二天将打击后的大鼠放在倾斜角为16°的动物跑台上，离心运动90 min，速度逐渐增大至16 m/min，余下5天休息。重复干预8周后，恢复4周。模型复制满足以下3个条件即为成功：①出现局部肌紧张带或结节；②静息状态下出现自发电位；③针电极刺激紧张带处出现局部抽搐反应。

1.4 电针干预

造模成功后，电针组大鼠采用0.35 mm×40 mm毫针斜刺并贯穿激痛点结节，提插、捻转引发局部抽搐反应后，连接电针仪，施以频率2～20 Hz的疏密波，电流强度以大鼠左下肢出现轻微颤动为宜，留针15 min，1次/d，连续治疗7 d。正常组、模型组大鼠在相同时间和地点采取相同方式进行抓取和固定，但不采取任何治疗措施。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 自发电活动频率检测 治疗结束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔麻醉，仰卧位固定后在左下肢股内侧肌部位寻找肌肉紧张带或结节，使用BL-420 S生物机能实验系统，电极针缓慢插入紧张带或结节处，每次移动电极针约1mm，当肌电图出现稳定的自发电活动时，记录发生的自发电活动频率，并予以标记。

1.5.2 动物取材 自发电位检测后，在标记处切取1 cm3肌肉组织，置于4%多聚甲醛固定。随后大鼠俯卧位，依次切开并剥离背部正中皮肤、筋膜和肌肉，打开椎管，取L4～6腰膨大段脊髓组织，浸泡于4%多聚甲醛中固定保存，供免疫组化检测使用。

1.5.3 苏木素-伊红染色(HE染色)观察激痛点周围肌肉组织病理变化 主要步骤：修材；4%多聚甲醛固定；梯度酒精法脱水；二甲苯透明；浸蜡包埋；石蜡机切片，厚度5μm；脱蜡；苏木精染色；透明、封固。400倍光镜下观察骨骼肌形态及病理变化。

1.5.4 免疫组化法检测大鼠脊髓背角GFAP、OX-42阳性细胞表达 主要步骤：脱蜡水化；滴加3%过氧化氢，室温下孵育20 min；滴加一抗(GFAP 1∶3000，OX-42 1∶1000)；滴加二抗，37℃温箱孵育；DAB显色；苏木精复染；脱水、透明、中性树胶封片。光学显微镜下随机选取高倍视野4个，观察GFAP、OX-42在脊髓背角中的阳性细胞表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠自发电位及活动频率比较

肌电图结果显示：正常组在静息状态下无异常自发电位；与正常组比较，模型组出现一系列高频低幅的背景电位(箭头处)和振幅相对较高的峰电位(虚线箭头处)，可持续超过30 s，但是不超过10 min；见图1A。与正常组比较，模型组自发电位活动频率明显增多(P<0.05)；与模型组比较，电针组有2只大鼠异常自发电活动消失，其余均可见偶发的自发电活动，且频率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1B。

灵敏度200 μV/D；扫描速度250 ms/D图1A 各组大鼠左下肢股内侧肌肌电图

与正常组比较▲P<0.05；与模型组比较■P<0.05图1B 各组大鼠左下肢股内侧肌自发电位活动频率比较

2.2 各组大鼠左下肢股内侧肌病理形态学变化

正常组大鼠横切面肌细胞多呈规则多边形，大小均匀，排列紧密、整齐，每个细胞边缘可见多个细胞核，且细胞核位于肌膜下(图2A横切面箭头)。纵切面肌纤维排列紧密、规律，粗细均匀一致，细胞核大多分布于肌纤维膜下(图2B纵切面箭头)。

模型组大鼠横切面可见多个大小不等的增大、圆染的肌细胞，增大肌细胞的周围多出现相对较小的圆形或椭圆形肌细胞(图2C横切面箭头)，并出现不同程度炎性细胞浸润与核内移现象(图2C横切面虚线箭头)。纵切面可见肌纤维粗细不等，排列紊乱，挛缩结节处出现大面积的粘连区域，并伴有大量炎性细胞浸润现象(图2D纵切面箭头)。

电针组大鼠横切面显示，肌细胞形态已基本接近于正常(图2E横切面箭头);纵切面显示，电针组肌纤维逐渐恢复，形态接近于正常组，但仍可见轻微萎缩、变性及炎性细胞浸润现象(图2F纵切面箭头)。

图2 各组大鼠左下肢股内侧肌病理形态学变化(×400倍)

2.3 各组大鼠脊髓背角GFAP阳性细胞表达

正常组大鼠脊髓背角中可见散在的浅棕褐色GFAP阳性神经细胞，突起细而小，胞体形态不清晰，模型组大鼠脊髓背角中GFAP阳性细胞明显密集，呈深棕褐色，表达增强，与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，电针组GFAP阳性细胞表达明显减少(P<0.05))，染色略浅。见图3A、图3B。

图3A 各组大鼠脊髓背角GFAP阳性细胞的表达(×100倍)

与正常组比较▲P<0.05；与模型组比较■P<0.05图3B 各组大鼠脊髓背角GFAP阳性细胞表达比较

2.4 各组大鼠脊髓背角OX-42阳性细胞表达

正常组大鼠在脊髓背角中可见少量OX-42阳性细胞；模型组阳性细胞数量密集，染色加深，胞体变大，突起缩短，从分支状变成变形虫样形态，与正常组相比，表达明显增强(P<0.05))；电针组OX-42阳性细胞与模型组相比，表达下降(P<0.05)。见图4A、图4B。

3 讨论

MPS属中医学“筋痹”范畴，病位在筋，《灵枢·刺节真邪》云：“一经上实下虚而不通者，此必有横络盛加于大经之上，令之不通”，指出本病因“横络”卡压致经脉气血不通所致。“横络”现代医学解释为肌肉组织因长期劳损或外伤形成的条索、结节或粘连等结筋病灶点，这与MTrPs的病理特点极为相似[6]。中医采用“以痛为腧”的理论和“解结”之法来解除横络治疗筋痹。现代医学认为直接精准靶向性灭活MTrPs是治疗慢性MPS的关键。临床研究[7]证实，电针治疗慢性MPS疗效确切，镇痛效果良好，故本实验选用电针激痛点。

图4A 各组大鼠脊髓背角OX-42阳性细胞表达(×400倍)

与正常组比较▲P<0.05；与模型组比较■P<0.05图4B 各组大鼠脊髓背角OX-42阳性细胞表达比较

MTrPs有隐性和活跃之分[1]。隐性MTrPs可被激活，不仅造成其所在肌肉组织局部疼痛，还引发远端牵涉痛[2]。牵涉痛发病机制与脊髓背角水平的中枢神经系统敏化密切相关[8]。神经胶质细胞(主要是星形胶质细胞和小胶质细胞)的激活是中枢敏化的重要机制之一[9]。GFAP和OX-42分别是星形胶质细胞和小胶质细胞常用的特异性标志蛋白，可反映星形胶质细胞和小胶质细胞的活性状态[4，9]。研究发现，当外周伤害性信号持续传向脊髓时，小胶质细胞能有效地感受伤害性刺激信号而被激活[10]。活化的小胶质细胞分泌NO、IL-1β等多种物质，并诱导星形胶质细胞活跃。上述2种神经胶质细胞活化后都能释放大量炎性因子及兴奋性氨基酸，通过MAPK途径参与慢性疼痛中枢敏化的发生发展过程[11]。神经病理性疼痛、CRPSⅠ型疼痛大鼠实验研究均证实，脊髓背角的GFAP和OX-42表达均显著增加，神经胶质细胞参与痛觉信息的整合与调控[12]。

本实验MTrPs激活部位在大鼠股内侧肌，主要由L4～6脊髓节段支配，故本实验以该节段为取材部位，观察该节段GFAP和OX-42蛋白表达变化。病理和自发电活动是MTrPs激活检测的客观指标[13]。本实验中模型组病理切片可见多个大小不等的增大、圆染的肌细胞，增大肌细胞的周围多出现相对较小的圆形或椭圆形肌细胞，肌电图仪记录到MPS大鼠出现自发电位，与前人研究[14]结果一致，说明MTrPs处于激活状态。经电针治疗后，MTrPs处肌组织接近正常组肌组织形态，自发电位频率降低，这说明电针能改善MPS大鼠肌组织形态，减少自发电活动，有效灭活MTrPs。与正常组比较，模型组大鼠L4～6脊髓GFAP和OX-42阳性表达明显增强，这提示星形胶质细胞和小胶质细胞大量活化，参与了MPS大鼠中枢敏化反应；经电针治疗后，MPS大鼠脊髓背角的GFAP和OX-42表达降低，说明电针MTrPs能抑制慢性MPS大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。

综上得出：电针能有效灭活慢性MPS大鼠激痛点，其机制或与调节中枢敏化反应，抑制脊髓背角GFAP、OX-42阳性细胞过表达有关。