泄泻患者腻苔与平人薄白苔舌面菌群差异性研究*

李 琪，孙 悦，丁成华，潘华平，齐城成，石国栋，董艳玉，李石林，袁丽霞

(江西中医药大学，南昌 330004)

舌苔是覆盖于舌背上的一层苔状物,因其可随病因病位及病势等的不同在颜色、厚薄、部位、质地等方面发生改变而成为中医望诊的重要内容，但对于这一现象形成的具体机制目前尚不明朗。有研究认为，舌苔类型与舌背黏膜上皮细胞的新陈代谢关系密切，而舌背菌群与舌背黏膜上皮细胞相互作用又可对舌背黏膜上皮细胞的新陈代谢产生重要影响，不同病证又对应不同的舌面菌群[1]。因而，不同病证所表现的特征性舌苔可能与其舌面菌群差异相关。为印证这一观点，本研究以泄泻病为例，以其临床常见黄腻苔和白腻苔为研究对象，利用目前运用较前沿的Illumina Miseq高通量测序技术，深入探究其舌面菌群物种及丰度的变化规律及与舌苔的相关性,为舌苔形成与变化机制的深入研究提供思路。

1 资料与方法

1.1 样本来源及分组

选取2018年4月至2019年5月在江西中医药大学附属医院就诊，由2位有经验的中医师采用盲法观察舌象诊断一致性程度较高且符合黄腻苔、白腻苔诊断标准的泄泻患者各60例，分别纳入YF组和WF组，同时选取符合正常薄白苔诊断标准的60名在校师生志愿者纳入NF组,均进行舌苔样本采集。

1.2 诊断标准

泄泻患者参照《泄泻中医诊疗专家共识意见(2017)》[2]诊断标准；舌苔均符合国家规划教材《中医诊断学》[3]与《中医舌诊图谱(中英对照)》[4]中黄腻苔、白腻苔和薄白苔的舌苔诊断标准。

1.3 纳入标准

符合上述诊断标准；近1个月内未服用益生菌、益生元、抗生素或中草药等可能对菌群有影响的药物；自愿参与并配合该研究并签署知情同意书。

1.4 排除标准

孕期或哺乳期妇女；过敏体质者；口腔炎症或牙周疾病者[5]。

1.5 标本采集

采样前2名采样人员经导师培训统一采样标准。在受试者早间未刷牙和未进食水的情况下，嘱咐其用0.9%氯化钠溶液漱口后，利用医用一次性木质压舌板由舌根处往舌尖方向力度适中刮取舌苔，并收集于装有3 mL 0.9%氯化钠溶液的无菌管中，置于冰盒短时间内送往实验室-80 ℃低温冰箱保存备用[6]。每例受试者1次采集2份样品。

1.6 舌面菌群DNA的提取

本研究使用 GV-Bacterial Genomic DNA Extraction Kit 细菌基因组 DNA 提取试剂盒，按照说明书提取样本总DNA，利用 1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计对抽提的基因组 DNA 进行浓度及纯度检测，筛选出优质样本并使用通用引物 338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)与806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对样本 16 S rRNA 的V3-V4 区域进行 PCR 扩增，扩增体系包括 5 × Fast Pfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，Fast Pfu Polymerase 0.4 μL，模板基因 10 ng并补足至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 预变性 3 min，再95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共30个循环后，72 ℃稳定10 min ,最后4 ℃保存。每个样本重复3次，并构建PE 扩增文库。使用 Illumina Miseq PE 300 平台进行测序。

1.7 数据分析

将测序得到的原始数据进行过滤处理，再根据97%的相似度对优化后的序列进行OTU聚类、剔除嵌合体，比对Silva数据库得到各样本的物种分类与注释信息。并基于美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com/)对样本进行多样性、物种组成、组间差异显著性检验及LEfSe 多级物种差异分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 测序序列信息统计

经过严格的质检和筛选后，3组样本共得到120份优质序列，每组40份。表1示，3组样本在性别、年龄、体质量指数(body mass index，BMI)、吸烟和酗酒等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。在这120份样本中有效序列数目为6 614 653条，平均55 122条，长度主要为401～440bp，平均423.49bp(图1)。基于OTU聚类结果的稀释性曲线随样本序列数目增加趋于平坦(图2)，表明测序深度合理，可以进行下一步分析。

表1 3组样本一般资料比较

注：x轴为长度区间，y轴为序列的数目图1 所有样本序列长度分布

注:一条稀释性曲线代表一个样本，其中红色代表黄腻苔组,蓝色代表白腻苔组,绿色代表薄白苔组图2 3组样本基于OTU水平的稀释性曲线

2.2 α多样性分析

α多样性分析是反映每组样品内的物种菌群丰富度和均匀性的一种分析方法，常见的评估指数有chao、ace、shannon 及 simpson，其中chao 指数和ace指数常用于评估物种丰富度，指数越大丰富度越高；shannon 和simpson指数常用来评估菌群多样性和均匀度，shannon指数越高simpson指数越低，说明菌群多样性越高[7]。图3示，3组样本在菌群丰富度和均匀性方面差异无统计学意义(P>0.05)。

注：图a、b、c、d分别代表chao、ace、shannon 及 simpson指数，红色代表黄腻苔组,蓝色代表白腻苔组,绿色代表薄白苔组图3 3组样本α多样性分析图

2.3 Beta多样性分析和分组分析

Beta多样性分析和分组分析主要分析样本间微生物群落组成的相似性，样本距离越近则表示样本的组成越相似。图4、5示，基于PCoA和NMDS的Beta 多样性分析，及基于PLS-DA回归模型和随机森林分析的分组分析中，X、Y轴两坐标系虽不能将3组样本完全分开，但各样本组内有聚类趋势，组间有离散趋势，说明3组样本组内群落相似度大于组间群落的相似度，分组具有意义。

注：图a为基于PCoA分析法的Beta 多样性分析，图b为基于NMDS分析法的Beta 多样性分析,图c为基于PLS-DA分析法的分组分析，图d为随机森林分析，图中两点距离的远近代表样本组成的相似性程度，距离越近则样本的组成越相似,红色代表黄腻苔组,蓝色代表白腻苔组,绿色代表薄白苔组图4 3组样本Beta多样性分析与分组分析比较

注：a、b、c分别代表门、目、属水平,1代表物种组成分析，2代表物种差异分析, *P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。图5 3组样本物种组成与差异分析

2.4 物种组成与差异分析

基于70% 的置信水平，与细菌数据库进行比对后发现，3组样本共有19个门，37个纲，97个目，166个科，326个属，603种细菌，以下主要从门、科、属这3个分类水平进行分析。

2.4.1 门分类学水平 图5a示，3组样本的优势菌门均为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。其中梭杆菌门和蓝细菌门(Cyanobacteria)在WF组中丰度较高，差异有统计学意义(P<0.05)。其余菌门虽在不同样本中的丰度占比不同，但差异均无统计学意义。

2.4.2 目分类学水平 图5b展示了15种相对丰度排名较前的菌目，其中拟杆菌目(Bacteroidales)、betaproteobacteriales、新月形单胞菌目(Selenomonadales)、乳杆菌目(lactobacillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、Pasteurellales、放线菌目(Actinomycetales)、梭菌目(Clostridiales)等8种菌目在3组样本中相对含量较高，共占总菌目的80%以上，而梭杆菌目、Pasteurellales、黄杆菌目(flavobacteriales)、芽孢杆菌目(bacillales)、叶绿体(chloroplast)5种菌目在3组样本中存在显著差异。其中，黄杆菌目在YF组丰度较高，梭杆菌目、芽孢杆菌目、叶绿体在WF组丰度较高，Pasteurellales在NF组丰度较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4.3 属分类学水平 图5c示，奈瑟氏菌属(neisseria)、普氏菌属(Prevotella_7、Prevotella、Prevotella_6)、韦荣球菌属(veillonella)、链球菌属(streptococcus)、嗜血杆菌属 (haemophilus)、梭菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、卟啉单胞菌属(porphyromonas)、alloprevotella，纤毛菌属(leptotrichia)、颗粒链菌属(granulicatella)、罗氏菌属(Rothia)、capnocytophaga、Agathobacter、Megamonas等17种菌属在3组样本中均存在明显聚集。而Prevotella_7、capnocytophaga、嗜血杆菌属、梭菌属和卟啉单胞菌属在3组样本中存在显著差异，其中capnocytophaga在YF组丰度较高，梭菌属和卟啉单胞菌属在WF组中丰度较高，Prevotella_7和嗜血杆菌属在NF组丰度较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 LEfSe多级物种差异判别分析

为进一步探究黄腻苔、白腻苔的菌群特征，通过 LEfSe 多级物种差异判别分析，试图筛选出差异物种并评估这些差异物种的影响力(LDA≥3，P<0.05)。图6a示，YF组主要富集α-变形菌纲、根瘤菌目(rhizobiales)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、黄杆菌(目、科)、capnocytophaga，WF组主要富集梭杆菌(门、纲、目、属)、蓝细菌门、生氧光细菌纲(oxyphotobacteria)、叶绿体、芽孢杆菌(目、科)、孪生菌属(gemella)、卟啉单胞菌(科、属)，NF组主要富集Pasteurellales、嗜血杆菌属、普氏菌(科、属)，与上述物种差异分析结果基本一致。而由进化分枝图(图6b)可知，YF组富集菌种主要来源于变形菌门下的根瘤菌科，拟杆菌门下的capnocytophaga、WF组富集的菌种，主要来源于梭杆菌门及其门下的梭菌、蓝细菌门及其门下的叶绿体、拟杆菌门下的卟啉单胞菌属及厚壁菌门下的孪生菌属，ZF组富集的菌种主要来源于拟杆菌门下的普氏菌属及变形菌门下的嗜血杆菌属。

注：图a为线性判别分析(Linear Discriminant Analysis,LDA)柱状图，LDA分值越大，代表该物种丰度对差异结果的影响越大，图b为LEfSe多级物种层级树图，圆圈从内到外依次代表门、纲、目、科、属水平，圆点代表各分类水平的物种，其中差异显著物种随组别进行着色，红色代表黄腻苔组,蓝色代表白腻组,绿色代表薄白苔组。图6 3组样本 LEfSe多级物种差异判别分析

3 讨论

本研究对比了泄泻患者黄腻苔、白腻苔与平人薄白苔的舌面菌群特征，发现上述3组样本的舌面菌群确实存在差异，该差异可能是导致不同类型舌苔形成的原因。

首先，多样性及分组分析表明，黄腻苔、白腻苔和薄白苔的舌面菌群在物种丰富度和多样性上具有相似性，但在菌群构成上存在差异，这与后面的样本组成与差异分析结果一致，即3组样本在各分类水平都具有相同的优势菌种,但各优势菌种在不同样本中的占比均不相同。

门水平上，3组样本的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门和放线菌门，与既往研究结果一致[8]。而除梭杆菌门和蓝细菌门在白腻苔显著富集外，其他菌门占比虽在3组样本中存在差异，但差异不显著。白腻苔多为中焦脾胃阳气亏虚、脾失健运,以致痰浊、水湿、饮食停聚舌面所致。而梭杆菌门被证实，在与痰证相关病变(如冠心病、慢阻肺等)患者中丰度显著升高[9，10]，蓝细菌门是水体及水产物的优势菌种，其含量在水库中表现为冬春季节高于夏秋季节[11，12]，在湿困脾胃证大鼠模型中显著升高[13]，说明这2种菌门可能具有嗜水湿和低温的特性，并参与机体的水湿代谢，这与白腻苔表征的寒湿、痰湿、水湿证候相符。

目水平上，3组样本除了共有优势菌目外，还出现了各自特征菌目，说明随着分类水平的深入，更多差异菌种可被发现。而结合进化分枝图可知，菌目的差异主要由其归属的菌属或菌科差异所致。即黄腻苔组富集了根瘤菌目下的根瘤菌科、黄杆菌目下的capnocytophaga，白腻苔组除了富集梭杆菌门下的梭菌、蓝细菌门下的叶绿体外，还富集来源于拟杆菌目下的卟啉单胞菌属及芽孢杆菌目下的孪生菌属，薄白苔组富集了拟杆菌目下的普氏菌属及Pasteurellales下的嗜血杆菌属。其中，根瘤菌目和Pasteurellaless归属于变形菌门，黄杆菌目和拟杆菌目归属于拟杆菌门，芽孢杆菌目归属于厚壁菌门。

根瘤菌属革兰氏阴性细菌，能将空气中的氮气转化为机体可吸收利用的化合态氮[14]，进而影响机体蛋白的合成，而某些蛋白参与舌上皮细胞的增殖、角化、脱落、免疫等进程，与腻苔的形成密切相关[15]。且成颖[16]等发现，该菌在黄苔中的丰度高于白苔，与本实验结果一致。同时该菌亦具有致病性，与猪肺炎发病相关[17]。Capnocytophaga是定植于口腔的条件致病菌，可引起脓肿、结膜炎、牙周炎、心内膜炎、败血症等炎性病变[18]。而黄腻苔是上述疾病的常见舌象，其表征的痰热、湿热或食积热腐等是上述疾病的常见证候。因此，黄腻苔的出现可能是机体炎性反应的结果，与Capnocytophaga和根瘤菌的功能活动有关。

卟啉单胞菌属为专性厌氧的革兰氏阴性菌,广泛存在于口腔及根系管道,包括牙龈卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌 、利氏卟啉单胞菌等，其中牙龈卟啉单胞菌是导致口臭、牙周病等口腔疾患的常见菌[19]。孪生菌属为兼性厌氧菌，为人体口腔、肠道和呼吸道的专性寄生菌，包括溶血孪生球菌、副溶血孪生球菌、血孪生球菌、麻疹孪生球菌、伯氏孪生球菌、台湾孪生球菌和不解糖卟啉孪生球菌7个菌种，这些菌均为人体正常定植菌，有时也可引起全身性感染[20]。两菌均被证实，在湿、寒、痰环境中显著富集[21-23]，与白腻苔表征的证候相符。白腻苔为水湿痰浊集聚舌面所致，易形成局部厌氧环境，利于厌氧菌、兼性厌氧菌的生长[24]，且腻苔患者口臭、牙周病率高，可能与牙龈卟啉单胞菌的过度生长有关。因而上述2种菌群可能与白腻苔的形成有关，与本实验结果相符。

普氏菌属为人体益生菌之一，其产生的短链脂肪酸具有增强机体上皮细胞屏障功能、维持黏膜免疫和调节能量平衡等作用[25，26]。按照中医“正邪”理论，该菌对机体的免疫、防御、营养作用属于中医的“正气”范畴。腻苔多主湿浊痰饮停聚病证，湿浊痰饮均为阴邪易伤阳气，导致机体阳气(正气)亏损。因而在腻苔患者中，该菌含量可能下降，与本实验结果相符。且该菌亦被证实，在健康机体常表现出高丰度[27，28]。嗜血杆菌属是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，仅寄生于人或动物的黏膜上，目前监测到该属细菌共有17个种，一些特殊的种可导致疾病，如流感嗜血杆菌、副猪嗜血杆菌等，该菌具有较低的耐酸性[29-31]，而腻苔患者舌苔pH值普遍低于正常舌苔且呈弱酸性[32]，这可能是嗜血杆菌属在正常舌苔的丰度高于腻苔的原因。

综上所述，泄泻患者的黄腻苔和白腻苔与健康薄白苔在舌面菌群上存在明显差异，其中变形菌门下的根瘤菌科、拟杆菌门下的capnocytophaga丰度显著升高，可能是泄泻黄腻苔的特征表现，梭杆菌门及其门下的梭菌、蓝细菌门及其门下的叶绿体、拟杆菌门下的卟啉单胞菌属及厚壁菌门下的孪生菌属丰度显著升高，可能是泄泻白腻苔的特征表现。同时上述2种舌苔普氏菌属丰度均下降，即益生菌数量下降，说明该舌象患者可能存在正气亏损的表现，在治疗过程中应注意补充益生菌或扶助正气。