葆青颗粒对卵巢储备功能下降模型大鼠性激素水平和Bax、Bcl-2、VEGF的影响*

林光耀，张米佳，叶 涛，聂 红，甯海燕，王永周

(西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)指卵巢内卵母细胞质量和(或)数量下降，并伴有血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)升高和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)降低，是导致女性生育能力下降和寻求辅助生殖技术(assisted reproductive technologies,ART)助孕的重要原因[1]。近年来，DOR的发生率从19%发展到26%并呈上升趋势[2，3]，但DOR的发病机理至今尚不明确。

目前西医对DOR的治疗主要包括口服雌孕激素类药物、脱氢表雄酮、生长激素和接受ART等方式，以调整月经周期和改善妊娠结局。但长期使用激素类药物大大增加了患乳腺癌、子宫内膜癌、脑卒中、卵巢癌等风险，同时较多的禁忌症也限制了激素类药物的应用[5-7]。因此，寻找治疗DOR疗效显著且更安全的方法，成为目前亟须解决的问题。中医治疗DOR具有多靶点、多途径和适应证广等独特优势[8]。前期临床观察发现，葆青颗粒能明显改善绝经前女性性激素水平，在治疗由激素变化引起的潮热、失眠和眩晕等方面效果更是优于雌激素且无不良反应，提示其对卵巢功能有保护作用[9，10]。本实验拟通过观察葆青颗粒对DOR模型大鼠性激素水平和Bax、Bcl-2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响，探讨葆青颗粒治疗DOR的作用与机制。本研究通过西南医科大学实验动物伦理委员会批准(批号2020767)。

1 材料

1.1 动物

清洁级10～12周龄雌性SD大鼠50只，体质量(250±10)g，由西南医科大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK(川)2018-17。所有动物自由饮水及摄食不含雌激素类饲料，室温保持在23～24 ℃，湿度保持在40%～60%，自然昼夜交替，每2～3 d更换垫料1次。所有大鼠适应饲养1周后连续2周行阴道脱落细胞学检查。

1.2 药物

葆青颗粒由熟地黄、山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子、五味子、肉苁蓉、龙骨组成，由西南医科大学附属中医医院制剂室生产(批号XZ20000050)。

1.3 主要试剂

注射用环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX，批号H32020857)、戊酸雌二醇片(商品名：补佳乐，批号J20171038)，西南医科大学附属中医医院；瑞氏-姬姆萨复合染液(型号G1020)，北京Solarbio科技有限公司；大鼠FSH试剂盒(型号34438)、黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)试剂盒(型号30447)、雌二醇(estradiol,E2)试剂盒(型号30267)、AMH试剂盒(型号30630)和VEGF试剂盒(型号30908)，睿信生物科技有限公司；重组Anti-Bax抗体(货号ab32503)，美国Abcam公司；Bcl-2抗体(货号AF6139)，中国Affinity公司；VEGF抗体(货号19003-1-AP)，美国Proteintech公司。

2 方法

2.1 模型制备

将10～12周龄雌性SD大鼠适应性喂养1周后，连续2周每日定时使用瑞氏-吉姆萨复合染液对所有大鼠行阴道脱落细胞观察。图1示，大鼠正常动情周期有以下特点：动情前期有核上皮细胞夹杂无核角化细胞；动情期大量无核角化细胞形态欠规则；动情后期有核上皮细胞、白细胞和无核角化细胞可同时被观察到；动情间期大量白细胞，偶见有核上皮细胞。筛选出正常动情周期的50只大鼠，随机选取10只纳入正常组，余40大鼠一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg诱导DOR模型[11]，正常组大鼠注射相同剂量0.9%氯化钠溶液。随后2周每日定时对造模组大鼠行阴道脱落细胞学观察，大鼠正常动情周期为4～5 d，若动情周期发生紊乱，并以动情周期延长为主要表现，则提示造模成功[12]。

注：A.动情前期；B.动情期；C.动情后期；D.动情间期图1 大鼠正常动情周期阴道脱落细胞观察(瑞氏-吉姆萨染色 ×100)

2.2 分组及给药

将38只成模大鼠(造模过程中意外死亡2只大鼠)按随机数字表法分为模型组、补佳乐组、葆青颗粒高剂量组(葆青高剂量组)和葆青颗粒低剂量组(葆青低剂量组)，模型组和葆青低剂量组各9只大鼠，余各组均纳入10只大鼠。葆青高、低剂量组大鼠连续3周每日定时灌胃葆青颗粒9 g/kg、3 g/kg，补佳乐组大鼠灌胃戊酸雌二醇片(0.21 mg/kg)，正常组和模型组大鼠均灌胃相同容积，0.9%氯化钠溶液。

2.3 取材及指标检测

末次给药后所有大鼠均禁食禁饮12 h，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，收集上清-80 ℃备检；万分位电子天平称重大鼠双侧卵巢组织，结果保留3位小数；左侧卵巢组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，4 ℃备检；右侧卵巢组织匀浆后-80 ℃备检。

2.3.1 一般情况 观察并记录大鼠大小便情况、精神状态与皮毛疏密程度。卵巢指数=双侧卵巢(mg)/大鼠体质量(g)×100%。

2.3.2 卵巢组织病理学观察 取出固定液中的卵巢组织，石蜡包埋、切片、HE染色，封片后在光镜下观察卵泡、黄体及颗粒细胞的病理形态学变化。

2.3.3 血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢组织VEGF水平检测 ELISA检测血清FSH、AMH、LH、E2和卵巢组织VEGF水平。以上操作均按照试剂说明书步骤进行。

2.3.4 卵巢组织中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表达 使用免疫组化法测定各组大鼠卵巢组织中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表达。取上述完成石蜡包埋的卵巢组织切片、脱水，消除过氧化物酶活性，一抗(浓度分别为1∶100、1∶100和1∶200)孵育过夜，二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染、脱水、封片，光镜下观察并选取卵泡数量较多的区域拍片。运用Image J图像处理软件，计算每张图片的光密度值。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠行为学观察

模型组和补佳乐组于灌胃第1周内分别意外死亡1只和2只大鼠。与正常组比较，模型组大鼠精神差，对外界刺激反应较迟缓，进食与饮水量减少，部分大鼠出现脱毛、大便稀溏或干燥、尿血。与模型组比较，各药物干预组大鼠精神状态佳，对外界刺激反应灵敏，进食与饮水量未见明显改变，毛色光滑，大小便未见异常。

3.2 各组大鼠卵巢湿重和卵巢指数比较

表1示，与正常组比较，模型组大鼠卵巢湿重和卵巢指数显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组卵巢湿重和卵巢指数均增高(P<0.05)。

表1 各组大鼠卵巢湿重与卵巢指数比较

3.3 各组大鼠卵巢组织形态学观察

图2示，与正常组比较，模型组卵巢组织中发育卵泡和颗粒细胞层较少，闭锁卵泡数较多，未见优势卵泡发育；与模型组比较，各治疗组卵巢组织中均可见各级卵泡及黄体，卵泡形态规则，颗粒细胞层及卵泡液含量丰富。

注：A.正常组；B.模型组；C.补佳乐组；D.葆青高剂量组；E.葆青低剂量组图2 大鼠卵巢组织形态学观察(HE ×100)

3.4 各组大鼠血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢组织VEGF水平比较

因正常组大鼠麻醉死亡3只，未收集到血液标本，故总采集血清标本42件。表2示，与正常组比较，模型组大鼠FSH和LH水平升高，AMH、E2和VEGF水平下降(P<0.05)。与模型组比较，各治疗组表现为FSH、LH水平下降和AMH、E2、VEGF水平升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢组织VEGF水平比较

3.5 免疫组化法测定各组大鼠卵巢组织中Bax、Bcl-2、VEGF表达结果

图3表3示，Bax、Bcl-2、VEGF均表达于卵巢颗粒细胞、各级卵泡和黄体细胞中。与正常组比较，模型组中Bax蛋白表达增强，Bcl-2和VEGF蛋白表达减弱(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组Bax蛋白表达减弱，Bcl-2和VEGF蛋白表达增强(P<0.05)。

注：A.正常组；B.模型组；C.补佳乐组；D.葆青高剂量组；E.葆青低剂量组图3 大鼠卵巢组织Bax、Bcl-2、VEGF免疫组化染色图(×400)

表3 免疫组化法测定各组大鼠卵巢组织Bax、Bcl-2、VEGF表达结果比较

4 讨论

现国内外对DOR的诊断尚缺乏特异性指标和统一标准[1]，故在临床诊疗中需结合患者年龄、临床表现及性激素水平做出综合判断[13]，如基础FSH>6.5 mIU/mL、窦卵泡计数<12或AMH<1.0 ng/mL，则提示卵巢储备功能开始下降。其中AMH分泌具有不受月经周期和外源性类固醇干扰等优势，其敏感性高于基础FSH，能较早地反映卵巢储备功能水平[14]。本研究模型组大鼠在注射CTX后出现血清FSH和LH水平升高，E2和AMH水平降低，卵泡和黄体数量明显减少，剩余卵泡趋于闭锁，提示采用一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg方法诱导DOR模型成功，与文献报道一致[12]。

DOR的发病机制尚未被完全阐明。目前诸多研究表明，细胞凋亡相关蛋白与DOR疾病的发生关系密切，其中Bax和Bcl蛋白对卵泡形成和闭锁的作用机制更是当前的研究热点[4]。随着对Bcl蛋白作用机制的深入探索，现根据其对细胞作用的不同被分为2个亚家族，首先是抗凋亡蛋白家族，包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和 A1；其次是促凋亡蛋白家族，包括Bax、Bak和Bok；其中Bax基因所编码的BCL2L4蛋白在激活后与Bcl-2蛋白形成异源二聚体，通过改变线粒体外膜通透性，诱导线粒体肿胀、破裂，促进胞质内细胞色素C释放，同时激活半胱氨酸天冬蛋白酶(caspases)，启动细胞凋亡的发生[15-17]。而Bcl-2通过抑制Bax释放细胞色素C，以阻断下游相关凋亡蛋白酶激活。因此在卵泡发育过程中，Bcl-2高表达可抑制卵母细胞和颗粒细胞中caspases活性，减少卵泡凋亡，而高Bax和/或低Bcl-2表达以及二者高比值则促进细胞发生凋亡[18-20]。此外，手术对卵巢血供以及周围组织正常解剖结构的损伤造成卵巢新生血管减少，导致卵泡生长发育所必需的营养物质缺乏，最终使卵泡中VEGF水平降低，闭锁卵泡数量增加，卵巢储备功能逐渐下降[21]。葆青颗粒的前期临床观察发现，诸多患者于妇科手术后和围绝经期出现潮热、月经紊乱以及性激素水平改变等一系列卵巢储备功能下降的临床表现，通过服用葆青颗粒后以上症状均有显著改善[9，10]。本实验结果显示，DOR模型组大鼠表现出FSH和LH水平升高，E2、AMH和VEGF水平下降，Bax蛋白表达增强及Bcl-2蛋白表达减弱。故推测Bax与Bcl-2水平比例失衡和VEGF表达降低导致卵泡生成和发育障碍，从而影响了血清激素水平的变化。

中医学虽无对DOR病名的记载，但其临床表现属于中医学“血枯”“年未老经水断”“闭经”和“不孕”等范畴[22]。《傅青主女科》载：“经水早断，似乎肾水衰涸”，认为肾乃先天之本，主藏精，精足化血，精亏血少，血海难溢，故经水早断；《妇人大全良方》中指出，经水由心血所化，肾气充盛，冲任通利，经血满盈，月经宣和，然血虚经枯无以滋养，经则难行也，故滋肾填精、养阴益血为其主要治法。葆青颗粒重用熟地黄补肾填精养血为君药；山药、山茱萸、菟丝子、枸杞子补肝肾、益精血，并增强熟地黄滋阴补血之力，以上4药合为臣药；佐以温补之品肉苁蓉，以契“阳中求阴”之妙；协五味子和龙骨补肾宁心，心肾相交，水火既济，针对DOR患者“肾水衰涸”表现恰好药证相符。同时，该方中大部分药物具有直接作用于细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的作用，如梓醇作为熟地黄提取物，可通过调节Bax/Bcl-2比值参与细胞凋亡过程[23]；山药的主要成分薯蓣皂苷元除具备以上作用外，还能作用于VEGF调节血管生成[24]；菟丝子和枸杞子具有抑制卵巢细胞凋亡、改善性激素水平等功效[25，26]。这也是葆青颗粒应用于DOR的现代药理学机制。

综上所述，葆青颗粒可通过降低卵巢组织中Bax蛋白表达，增强Bcl-2和VEGF蛋白表达，从而改善DOR模型大鼠性激素水平，还可通过减少卵巢内卵泡闭锁，增加颗粒细胞层及卵泡液含量起到治疗DOR的作用。