乳香醋炙前后对血瘀模型大鼠改善作用的对比研究*

张琳琳，刘振丽，王 淳，彭诗涛，宁张弛△，宋志前△

(1.浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052；2.国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室， 杭州 310052；3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

乳香为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.及同属植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw，树皮渗出的树脂具有活血定痛、消肿生肌的功效，主治胸痹心痛、产后瘀阻、跌打损伤和风湿痹痛等血瘀证[1]。乳香始载于《名医别录》，后《本草纲目》《证类本草》均有记载并沿用至今[2]。现代药理学研究表明，乳香具有抗肿瘤、抗炎、止痛、调节免疫等作用[3-7]。中医认为炮制辅料醋入肝经，具有活血行气、散瘀解毒、开胃养肝等功效[8]。乳香醋炙后能增强活血化瘀、消肿止痛功效，并能降低其刺激性，因此中医临床常用乳香的炮制品醋乳香饮片入药[9]。

由瘀血内阻而引起的病证，中医称为血瘀证[10]，可涉及现代医学的肿瘤、冠心病、脑梗死、免疫性疾病等多种疾病。已有研究证明，乳香具有较好的活血化瘀作用，但其醋炙前后对血瘀证模型动物的作用差异研究较少。

本研究拟从体内体外两方面评价乳香醋炙前后对大鼠血瘀模型的改善作用。体外实验采用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)为诱导剂，比较乳香和醋乳香对大鼠体外全血血小板聚集的影响。体内活血作用拟采用大鼠寒凝血瘀模型，以血液流变指标和凝血因子指标比较乳香和醋乳香的体内活血作用。通过探讨乳香醋炙前后体内外活血作用的药效学差异，以期阐明乳香醋炙的科学性和合理性。本研究通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物福利伦理审查委员会批准(批准号2020-066)。

1 材料

1.1 动物

采用清洁级SD雄性大鼠，体质量(280±10)g，购于中国食品药品检定研究所，实验动物许可证号SYXK(京)2017-0005。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物房，环境温度(25±2)℃，相对湿度50%～70%，常规适应性饲养1周后开始实验。

1.2 药物

乳香购于北京同仁堂药店(批号805270216)，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.树皮渗出的树脂；阿司匹林肠溶片，拜耳医药保健有限公司，批号BJ16287；盐酸肾上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号1312151。

1.3 主要试剂及仪器

ADP(批号212010319)，北京博奥拓达科技有限公司；异氟烷(批号19021501)，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；凝血酶原时间(prothrombin time，PT)测定试剂盒(批号STY20301-49)、凝血酶时间(thrombin time，TT)测定试剂盒(批号STY20101-75B)、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)测定试剂盒(批号STY20401-57)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)试剂盒(批号STY20201-46)，北京中勤世帝科学仪器有限公司；肝素真空采血管(批号20190801)、枸橼酸钠真空采血管(批号20190701)，江苏宇力医疗器械有限公司。

LD5-10低速台式离心机(北京瑞邦兴业科技有限公司)；590 Whole-Blood aggregometer全血血小板聚集仪(Chrono-LOG公司)；LG-Paber-Ⅱ全自动凝血因子分析仪(北京世帝科学仪器)；BT-300全自动血液流变仪(北京博莱特通科技有限公司)。

2 方法

2.1 乳香、醋乳香混悬液的配制

根据课题组前期研究结果[11]和2020版《中华人民共和国药典》[1]制备醋乳香。称取乳香适量置炒锅中，采用中火炒制9 min后表面微溶，按照10∶1比例喷淋米醋，继续翻炒，约11 min后观察到表面呈油亮光泽时迅速取出，将炒制好的醋乳香转移至托盘中，摊放晾凉备用。

取等量的乳香和醋乳香，相同条件下粉碎，过100目筛。按照70 kg人体用药剂量，用0.5%羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)溶液制成浓度为86.4 g/L的乳香和醋乳香混悬液，4 ℃储存备用。用时室温放置60 min，振摇使其混匀。

2.2 体外全血血小板聚集试验

2.2.1 ADP溶液的配制 取ADP适量精密称定，加0.9%氯化钠溶液制成每1 mL含0.4 mg ADP的溶液。

2.2.2 大鼠麻醉和取血 取6只正常大鼠以异氟烷呼吸麻醉，待大鼠麻醉成功后腹主动脉取血，置于肝素钠抗凝管中待测。

2.2.3 供试品溶液制备 取乳香和醋乳香粉末3 g，加25倍95%乙醇超声30 min提取2次，过滤并合并滤液，减压干燥，残渣用20 mL 2%氢氧化钾溶解即得。取阿司匹林片粉碎，称取10 mg于10 mL 2%氢氧化钾溶解即得。

2.2.4 全血血小板聚集测定 测定全血血小板聚合值常用的方法有比浊法和电阻法[12]。本实验采用电阻法，以2%氢氧化钾为空白对照组、阿司匹林为阳性对照组，通过比较乳香、醋乳香提取物对ADP诱导正常大鼠全血血小板聚集的聚合值以及电阻变化斜率，考察乳香醋炙前后对体外全血血小板聚集的影响。具体方法为：5个反应杯中均放入磁棒，置于预温孔(37 ℃)预温10 min，依次加入0.9%氯化钠溶液500 μL、肝素钠抗凝全血500 μL后，阳性对照组及乳香、醋乳香组分别加入阿司匹林、乳香和醋乳香供试品溶液10 μL，空白对照组加入2%氢氧化钾10 μL。将反应杯放入反应孔中，反应5 min插入检测电极，待基线平稳2 min后，加入10 μL ADP溶液于反应体系中，记录电阻的变化曲线，测定并比较各组血小板聚合值及电阻变化曲线斜率。

2.3 体内活血实验

2.3.1 寒凝血瘀证大鼠模型 采用注射肾上腺素和冰水浴刺激的方法建立寒凝血瘀证动物模型[13]。大鼠皮下注射盐酸肾上腺素(0.8 mg/kg)，2 h后置于4 ℃冰水中游泳3.5 min，用毛巾擦拭，吹风机吹干，等待2 h后再皮下注射等剂量的盐酸肾上腺素，末次给药后禁食12 h后采血。

2.3.2 动物分组及给药方法 将模型动物分为模型组、乳香组(0.90 g/kg)、醋乳香组(0.90 g/kg)、阳性药组(54 mg/kg)4组各6只。正常组与模型组灌胃给予0.5% CMC-Na溶液，给药组按上述剂量分别灌胃给药，每天给药1次，连续给药2周。

2.3.3 血液流变学指标检测 末次给药后禁食12 h。各组大鼠吸入异氟烷麻醉，经腹主动脉取血后置于肝素钠采血管，用于全血黏度、血沉及红细胞压积的检测。另取抗凝血液1 mL，离心后取血浆测定血浆黏度。

2.3.4 凝血因子指标检测 腹主动脉取血，置于3.2 %枸橼酸钠抗凝管(1∶9)中，离心后取血浆，检测PT、APTT、TT、FIB、血沉及红细胞压积水平。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 乳香醋炙前后对ADP诱导全血血小板聚集作用

采用ADP诱导大鼠全血血小板聚集试验，比较醋乳香和乳香体外活血活性(见图1)。与对照组比较，阿司匹林组、醋乳香组和乳香组的血小板聚合值和斜率均显著下降(P<0.05，P<0.01)，且醋乳香组血小板聚合值和斜率低于乳香组。结果表明，醋乳香较乳香能够更好地抑制ADP诱导的全血血小板聚合值及斜率。

注：A.血小板聚合值；B.斜率；与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01图1 乳香醋炙前后对ADP诱导的全血血小板聚集试验结果

3.2 乳香醋炙前后对寒凝血瘀模型大鼠血液流变学指标的作用

以寒凝血瘀模型对比醋乳香和乳香对体内血液流变学的影响(结果见表1)。与正常组比较，模型组5个切变率下的全血黏度、血浆黏度、血沉以及红细胞压积均显著提升(P<0.05，P<0.01)，表明模型制备成功。与模型组比较，醋乳香组和阳性药组切变率1(1/s)的全血黏度、血浆黏度及红细胞压积均显著下降(P<0.05或P<0.01)，而乳香组仅有红细胞压积明显下降(P<0.05)。结果表明，在改善寒凝血瘀模型大鼠血液流变学方面，醋乳香的作用优于乳香。

表1 乳香和醋乳香对大鼠血液流变学的影响

3.3 乳香醋炙前后对寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的作用

比较醋乳香和乳香对寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影响(见表2)。与正常组比较，模型组TT和PT值显著降低，FIB值显著升高(P<0.05，P<0.01)，表明寒凝血瘀模型造模成功。与模型组比较，阳性药组以及醋乳香组的TT和PT值显著升高，FIB值显著降低(P<0.01)；乳香组仅TT值明显上升(P<0.01)。结果表明，醋乳香比乳香抑制寒凝血瘀模型大鼠凝血功能效果更好。

表2 乳香醋炙前后对寒凝血瘀模型大鼠凝血因子的影响

4 讨论

《素问·调经论篇》：“血气者，喜温而恶寒，寒则泣不能流，温则消而去之。”《灵枢》：“寒邪客于经络之中，则血泣，血泣则不通。”中医认为“寒气入经而稽迟，泣而不行”，即寒邪使血脉运行不畅而致寒凝血瘀，以及形成“恶血”与“留血”等[10]。血液流变学主要是通过检测血液黏度和凝集、红细胞的聚集以及全血血小板的聚集等指标来研究血液的流动性及变形性规律[14]。血液流变学异常主要表现为血流速减慢、黏度增高，呈“黏、浓、凝、稠、聚”状态。凝血因子是评价机体血液凝血功能的重要指标，PT反映血浆中凝血因子X、Ⅶ、Ⅱ、V和I水平，APTT反映血浆中凝血因子Ⅺ、Ⅸ和Ⅷ水平，TT反映血液中凝血因子的抗凝剂是否增加。FIB是一种具有凝血功能的蛋白质，可促使红细胞聚集[15，16]。血瘀证的表现与血液流变学及凝血功能异常颇为一致，故临床常将血液流变学和凝血因子作为评价血瘀证的重要指标。本研究采用冰浴应激加肾上腺素方法，模拟寒凝血瘀证的病理过程制备动物模型。基于凝血因子和血液流变学指标评价乳香醋炙前后对寒凝血瘀证大鼠干预作用的差异，结果表明醋乳香改善寒凝血瘀大鼠血液流变学和抗凝血的作用更强。此外，ADP是一种血小板释放的自体凝血物质，其通过血小板膜的ADP受体诱导血小板聚集。研究借助ADP诱导血小板聚集的体外实验，比较乳香醋炙前后的解聚作用，结果表明醋乳香对ADP诱导的全血血小板聚集的抑制作用更强，可见乳香醋炙对活血活性的增效作用可能与血液中血小板的ADP受体有关。

血瘀证作为临床重要证型之一，现代医学认为与血液流变学异常、微循环障碍、免疫性炎症反应以及结缔组织代谢异常等病理变化有关，而血管内皮细胞变化是病变的中心环节[17]。现代药理学研究表明，乳香可以降低炎性因子白细胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的分泌，从而改善血管内皮细胞功能障碍[18]。乳香提取物对微血管内皮细胞的抗炎作用是基于其系统调控TNF-α诱导基因变化而发挥的，如基质金属蛋白酶(matrix metallopeptidase，MMP)-3、MMP-10和MMP-12[19]。最新1项研究成果证实，乳香对于糖尿病微血管病变、糖尿病足也有一定的改善作用，其可以通过抑制氧化炎症标志物表达，促进胶原合成，加快愈合速度，显著减少伤口细胞坏死程度[20]。

药效作用的产生与物质基础密切相关。课题组前期对炮制辅料醋和乳香化学成分开展了相关研究。研究发现，炮制辅料醋中具有活血止痛作用的川芎嗪、四氢哈尔满碱、麦角胺等活性成分，这些成分是乳香醋炙后活血止痛作用增强的重要物质基础[21]。乳香最主要的活性物质是三萜类的乳香酸成分[22，23]，主要包括11-羰基-β-乳香酸(11-keto-β-boswellic acid，KBA)和3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-β-boswellic acid，AKBA)、乙酰-β-乳香酸(acetyl-β-boswellic acid，β-ABA)、β-乳香酸(β-boswellic acid，β-BA)等[24，25]。乳香中的主要乳香酸成分AKBA可以通过介导核因子(nuclear factor，NF)-κB通路发挥抗动脉粥样硬化的作用[26]，β-BA可以刺激内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的释放，从而改善血瘀引发的内皮功能紊乱[27]。乳香的水提取液通过抑制p38 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen0activated protein kinase，MAPK)和热休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)27通路，削弱血小板源生长因子对主动脉平滑肌细胞的增殖和迁移作用[28]。课题组前期研究结果显示，乳香醋炙后AKBA与β-BA的含量大大提升，同时还发现具有9,11-去氢结构的乳香酸成分在醋炙后含量增加10.8倍。而体外初步的抗炎筛选结果也表明，该类成分的抗炎活性与AKBA和β-BA类似[29]，这可能也是乳香醋炙后改善血管内皮细胞功能障碍和动脉粥样硬化作用增强的原因。

分子生物网络系统进一步揭示乳香醋炙前后差异化学成分药理作用和作用机制，结果显示[29]炎症反应是血管的初级反应，乳香醋炙前后可能通过介导血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGFA)、MMP-9、TNF、IL-1β、转录后基因沉默(post-transcriptional gene silenceing，PTGS)等炎症相关靶点增效对血管炎症的干预效果，其中VEGFA可促进新生血管形成，增加血管通透性[30]，而MMP-9与创面愈合及血管新生过程高度相关[31]。TNF和IL-1β是血管病变出现引发核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体活化等细胞焦亡过程中的作用靶点[32]。网络药理学预测结果显示[29]，乳香醋炙后作用增强的通路如晚期糖基化终产物及其受体(advanced glycation end products and their receptors，AGE-RAGE)信号通路、NF-κB信号通路等均与血管病变的改善作用密切相关，而研究表明抑制和阻断二者能够增加VEGF、一氧化氮等因子分泌，从而促进血管新生[30]。

中医理论认为，气、血、津液的运化失调是导致血管病变的本质原因，其病理产物痰、瘀、浊、毒在血脉中的蓄积则是关键的致病因素[33，34]。乳香味辛性散，具有走窜的特性，其既行气分又入血分，内至脏腑宣通气血，外至经络通达瘀滞[35]，而乳香醋炙后可以增强其活血化瘀的作用特点。故本实验开展乳香和醋乳香的药效对比研究，为扩展传统中药炮制的临床应用、推动中医药现代化进程、揭示传统中药炮制理论的科学内涵提供参考。