超声辅助酶法提取黔产青钱柳多糖

◎ 吴超群，佀胜利

（凯里学院，贵州 凯里 556000）

青钱柳（Cyclocarya paliurus）又名青钱李、摇钱树、山沟树等，是我国特有的珍稀植物，具有广泛的食用和药用价值。《全国中草药名鉴》有记载：“青钱柳树叶、树皮及其根，能杀虫止痒，有消炎、止痛、祛风之功效”，民间常用于清热消肿、生津止渴，被誉为降糖神茶[1]。青钱柳叶中含有多种活性成分，包括黄酮类物质、三萜类物质、多糖、有机酸类等[2-3]。其中青钱柳多糖是主要的活性成分之一，并且已被证实具有降血糖、降血脂、抗氧化及抗癌等多种生理活性[4-7]。

目前多糖提取方法有热水浸提法[8]、酸水解[9]、碱提法[10]、溶剂回流提取[11]等，但提取效率不高。超声利用粉碎、空化特性破坏植物细胞，结合酶法通过纤维素酶分解细胞壁，加速有效成分的溶出，超声辅助酶法结合两者优势，相较于传统提取方法，其具有高效、省时的优点。本文以黔产青钱柳为原料，采用超声辅助酶法提取，应用单因素试验与正交试验优化提取工艺，为青钱柳的开发利用以及其生物学活性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黔东南地区青钱柳叶，干燥，粉碎过60目筛；纤维素酶，30 U·mg-1，和氏璧生物科技有限公司；D(+)-无水葡萄糖标准品，纯度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；磷酸氢二钠，分析纯，天津市天大化学试剂；柠檬酸钠，分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司；苯酚、浓硫酸，分析纯，西陇科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

VGT-2127QTD数显恒温超声仪器，上海旦鼎国际贸易有限公司；AF-04A粉碎机，温岭市奥力中药器械有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；AR224CN电子天平，奥豪斯仪器有限公司；AXTD5A离心机，盐城市安信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青钱柳多糖提取方法

准确称取青钱柳粉末0.5 g置于50 mL离心管中，加入适量的纤维素酶及适量的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液调整pH，在50 ℃下酶解适宜时间，再进行沸水灭酶15 min，超声一定时间，4 000 r·min-1离心15 min，取上清液定容100 mL，待测。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取葡萄糖标准品10.00 mg，加蒸馏水定容至50 mL，制得0.2 mg·mL-1的标准品溶液。精密吸取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL的标准品溶液，加蒸馏水定容至25 mL，备用。再分别移取备用液2 mL于6个具塞试管中，分别加入6%苯酚溶液1 mL与浓硫酸溶液5 mL，摇匀，静置30 min，于490 nm波长处测吸光度。以吸光度A为纵坐标，葡萄糖标准瓶浓度C（mg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：A=0.109 9C+0.005 7，R2=0.999 5。

1.3.3 青钱柳多糖的含量测定

精密吸取青钱柳待测液1 mL，按上述方法，于490 nm下测定吸光度。根据标准曲线计算青钱柳多糖质量浓度，根据式（1）计算青钱柳多糖含量：

式中：n为稀释倍数；C为标准曲线计算得青钱柳质量浓度，mg·mL-1；V为青钱柳提取液体积，mL；m为青钱柳质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

在黔产青钱柳多糖提取工艺单因素试验中，分别选取酶添加量、酶解pH、超声时间3个主要因素，其中酶添加量分别为2%、3%、4%、5%和6%；酶解pH分别为4、5、6、7和8；超声时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，采用青钱柳多糖提取含量为评价指标，考察不同因素对其提取含量的影响。

1.3.5 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取酶添加量、酶解pH、超声时间3个单因素，采用L9(34)正交试验，以青钱柳多糖含量为指标，确定超声辅助酶法提取青钱柳总多糖的最佳提取工艺条件，正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.6 数据处理

采用正交设计助手ⅡV3.1对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶添加量结果分析

按“1.3.4”项下方法，以青钱柳总多糖含量为考察指标，考察不同酶添加量对青钱柳总多糖含量的影响。由图1可知，随着酶添加量的增加，青钱柳多糖的含量呈现先升高后再降低趋势，当酶添加量为4%时，青钱柳多糖含量达到最高，但酶添加量高于4%时，青钱柳多糖含量随着酶添加量的增加而下降。

2.1.2 酶解pH值结果分析

按“1.3.4”项下方法，以青钱柳总多糖含量为考察指标，考察不同酶解pH值对青钱柳多糖含量的影响。由图2可知，随着酶解pH值的增加，青钱柳多糖含量呈现先升高再降低的趋势，当酶解pH为6时，青钱柳多糖含量达到最高，而后随着酶解pH的升高青钱柳多糖含量降低，主要是由于维持酶的活性需要适宜的pH，pH过高或者过低都会影响酶的活性。

2.1.3 超声时间结果分析

按“1.3.4”项下方法，以青钱柳总多糖含量为考察指标，考察不同超声时间对青钱柳多糖含量的影响。由图3可知，随着超声时间的增加，青钱柳多糖含量呈现先升高再降低的趋势，当超声时间为30 min，青钱柳多糖含量达到最高，此时酶促反应与超声效果均达到最佳。当超声时间超过30 min，青钱柳多糖含量随时间增加逐渐降低，可能是由于超声时间过长使部分青钱柳多糖因剪切力过大而结构裂解，造成含量减少。

2.2 正交试验结果分析

在单因素试验基础上，结合正交试验因素水平表，对酶添加量（A），酶解pH值（B）、超声时间（C）3个因素，以青钱柳多糖含量为指标开展正交试验，试验结果如表2所示。由R值可知，影响青钱柳多糖含量的主要因素排列顺序为酶解pH＞酶添加量＞超声时间。由K值可知，最优组合为A2B2C1，即酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超声时间30 min。

表2 正交试验结果表

2.3 验证试验

为验证L9(34)正交试验优化青钱柳多糖提取工艺可靠性，准确称取0.5 g青钱柳粉末于50 mL离心管中，分别在A2B2C1条件下进行试验，平行3次，测定青钱柳多糖含量为16.23%，RSD值为1.72%，均高于单因素与正交试验的多糖含量，表明超声辅助酶法提取青钱柳多糖的最优条件（A2B2C1）稳定合理。

3 结论

本研究通过单因素试验和正交试验优化得到超声辅助酶法提取黔产青钱柳的最优工艺为酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超声时间30 min。验证试验结果显示，在最优条件下，青钱柳多糖含量为16.23%，RSD值为1.72%，表明该提取方法可靠，可用于青钱柳多糖提取，为青钱柳的进一步开发利用奠定基础。