基因VI型新城疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

王静静，于晓慧，克军宏，2，彭真奇，3，邢安琪，4，刘华雷

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.塔里木大学，新疆阿拉尔 843300；3.安徽农业大学，安徽合肥 230036；4.宁夏大学，宁夏银川 750021）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株感染引起的一种禽的急性、高度接触性传染病，是严重危害养禽业的重要疾病之一，给养禽业造成巨大经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。NDV 具有遗传多样性，根据病毒F基因差异可分为I 和II 两大类，I 类NDV 只有1 个基因型，均为弱毒株；II 类NDV 至少包括21 种基因型，其中既有弱毒株也有强毒株[1]。目前我国流行的强毒株主要为基因VI型和VII型，且病毒具有明显的宿主特异性[2-3]。20 世纪80 年代后，基因VI型NDV 传至世界各地，并一直在鸽群中流行和传播[4-5]。国家新城疫参考实验室监测数据显示，近年来我国鸽群NDV 强毒阳性率呈上升趋势[6]，提示应对鸽群中基因VI型NDV 强毒株加以关注。

目前，我国ND 诊断主要依靠RT-PCR 结合测序。NDV 强毒鉴定可通过测定1 日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）或病毒F 蛋白裂解位点序列分析进行，通过病毒F 蛋白裂解位点碱性氨基酸数量判定病毒毒力。该方法检测周期较长，无法满足快速检测的需求。此外，多家实验室也建立了NDV强毒株荧光RT-PCR 检测方法[7-9]，用于NDV 强毒株的快速筛查，但这些方法均无法区分病毒基因型，所以目前仍无专门针对基因VI型NDV 的快速检测方法。为了满足基因VI型NDV 的检测需求，本研究针对NDVF基因设计特异性引物和探针，建立了一种特异性强、敏感性高、快速有效的基因VI型NDV 检测方法，为开展鸽群ND 的早期诊断提供了重要支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 I 类（基因1.1.2 亚型）、II 类（基因I型、II型、VI型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亚型）、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、减蛋综合征病毒、禽脑脊髓炎病毒等，均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.1.2 临床样品 120 份鸽口咽/泄殖腔拭子，由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存。

1.1.3 试剂盒 High Pure Viral Nucleic Acid Kit核酸提取试剂盒，购自Roche 公司；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 RT-PCR 试剂盒，购自TaKaRa 公司；SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit 荧光RT-PCR 试剂盒，购自Invitrogen公司。

1.1.4 cRNA 标准品 基因VI型NDV cRNA 标准品，由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室制备和保存。

1.1.5 鸡胚 9～11 日龄SPF 鸡胚，购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.2 引物、探针设计和筛选

从GenBank 上下载NDVF基因序列，采用MEGA 6 进行序列比对分析，选取基因VI型NDV保守区域设计特异性引物和探针（表1）。引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 荧光RT-PCR 引物和探针

1.3 病毒核酸提取

按照核酸提取试剂盒说明书操作，提取病毒核酸，立即用于实时荧光RT-PCR 或RT-PCR 扩增，或置-80 ℃保存备用。

1.4 反应体系建立与优化

以提取的基因VI型NDV RNA 为模板，按照实时荧光RT-PCR 试剂盒说明书配置反应体系，进行荧光RT-PCR 扩增，确定最佳引物和探针浓度以及退火温度和时间。

引物探针浓度优化：固定反应体系引物终浓度为0.5 μmol/L，探针浓度分别为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 和0.50 μmol/L。根据检测Ct 值确定最佳探针浓度。

退火温度优化：退火温度分别设置为58、59和60 ℃，通过比较Ct 值确定最佳退火温度。

退火时间优化：退火时间分别设置为30、40、50、60 和70 s，通过检测Ct 值确定最佳退火时间。

1.5 特异性试验

选择具有代表性的12株基因VI型NDV，以及I 类（基因1.1.2 亚型）、II 类（基因I型、II型、VII型）NDV、禽流感病毒（H5、H7、H9 亚型）、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽腺病毒、减蛋综合征病毒、禽脑脊髓炎病毒，提取核酸进行荧光RT-PCR扩增，评价方法的特异性。

1.6 敏感性试验

将基因VI型NDV cRNA 标准品进行10 倍倍比稀释，取浓度为5×109～5×100copies/μL 的样品进行荧光RT-PCR 扩增，每个稀释度做3 个重复。

1.7 临床样品检测

用建立的荧光RT-PCR 方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测，并与病毒分离方法（病毒繁殖、RT-PCR 扩增和序列分析）检测结果进行比较。

2 结果

2.1 反应体系建立和优化

以基因VI型NDV RNA 为模板进行荧光RT-PCR 扩增，优化反应体系和反应条件。确定的最终反应体系：2×Reaction Mix 10.0 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，探针（10 μmol/L）0.5 μL，RTTaqMix 0.5 μL，模板RNA 2.0 μL，DEPC 水6.0 μL，总体积20.0 μL。反应条件：50 ℃30 min，95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45 次循环。每次循环在60 ℃时收集荧光信号。

2.2 特异性试验

用国内流行的5 种基因型NDV 和其他9 种常见禽病病毒核酸进行特异性试验。结果（图1）显示：只有12株基因VI型NDV 核酸经荧光RTPCR 扩增后出现特异性扩增曲线，基因1.1.2 亚型、基因I型、II型NDV 弱毒，基因VII型NDV 强毒，以及其他常见禽病病毒核酸经荧光RT-PCR 扩增后均无扩增曲线。

2.3 敏感性试验

以浓度为5×109～5×100copies/μL 的cRNA样品进行荧光RT-PCR 扩增，每个稀释度做3 个重复。结果（图2）显示，荧光RT-PCR 检测下限为5 copies/μL。

2.4 临床样品检测

用建立的荧光RT-PCR 方法对临床采集的120份鸽口咽/泄殖腔拭子样品进行检测，结果检出阳性样品17 份，检测结果与病毒分离方法完全一致，说明本研究建立的荧光RT-PCR 方法可信度高，可用于临床样品中基因VI型NDV 检测。

3 讨论

ND 是影响我国养禽业发展的主要疫病之一。目前我国流行的NDV 强毒株分属3 个基因型，即基因型VI型、VII型和XII型。其中，基因VII型和XII型NDV 分别在鸡群和鹅群中流行，基因VI型NDV 在鸽群中流行。基因VI型NDV 曾被称为鸽副黏病毒I型（pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1），是鸡源NDV 跨种传播至鸽后产生的变异株，也是导致全球第三次ND 大流行（20 世纪70 年代后期至80 年代）的主要流行毒株[10]。20 世纪80 年代我国首次分离到基因VI型NDV，随后该基因型毒株一直在我国鸽群中流行。国家新城疫参考实验室监测数据显示，近十年间鸽NDV强毒阳性率明显高于鸡和水禽，且近两年基因VI型NDV 流行强度明显升高。基因VI型NDV 在我国分布广泛[2，5，11]，没有明显的地域性，已经成为我国当前流行最为广泛的强毒株，也是危害养鸽业健康发展的主要病原之一。因此，需要加强基因VI型NDV 的监测预警，建立快速灵敏特异的检测方法，为鸽ND 的早期诊断提供技术储备。

目前，ND 弱毒活疫苗的普遍使用和弱毒株的大量存在[12-13]，给ND 确诊带来巨大挑战。由于NDV 只有一个血清型，单纯检测NDV 的血清学方法（血凝抑制试验）和强弱毒通用的RT-PCR 技术已无法满足快速确诊和早期诊断的需求。ND 确诊需要依靠病毒致病性评价。传统的毒力测定方法为生物学试验，即ICPI 测定，此方法检测周期长，且需要一定级别的生物安全实验室，不适合大规模推广应用。目前，病毒毒力鉴定常用常规RT-PCR技术结合序列分析，但测序所需时间较长，无法满足快速检测的需求。近年来，反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和荧光RT-PCR 等分子生物学技术也被用于NDV 检测[8，14-15]，但现有方法主要是针对疫苗毒和基因VII型、IX型强毒株。本研究建立了一种基因VI型NDV 荧光RT-PCR 检测方法，可在2.5～3 h 内完成样品检测，具有操作简单、特异性强、敏感性高、准确性好等优点，适用于大批量临床样品检测。